Der Einfluss von oraler Glukosebelastung auf monozytäre NF-κB regulierte Gene

Humane Blutmonozyten werden bei oraler Glukoseaufnahme aktiviert, woraufhin die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ansteigt und NF-κB vermehrt in den Zellkern transloziert wird [38, 41]. Daher wurden in dieser Arbeit die Genexpressionen der NF-κB regulierten Gene IL-6, IL-8, SOD2 und Resistin in Monozyten von jungen, insulinsensitiven Probanden vor und 2 h nach einer oralen Glukosebelastung untersucht.

Die Insulinsensitivität konnte anhand des HOMA-Indexes quantifiziert werden. Die HOMA-Indices aller Spender lagen unter 1, was bei keinem der Teilnehmer eine Insulinresistenz oder eine verminderte Insulinsekretion vermuten lässt.

4.1.1 Das Zytokin IL-6 wird durch orale Glukosebelastung im Plasma reduziert, während die Sekretion in Monozyten nicht verändert wird Die mRNA Expression von IL-6 wurde 2 h nach oraler Glukosebelastung in Monozyten nicht beeinflusst. Dies konnte durch in vitro Versuche bestätigt werden, in denen weder die Stimulation mit Glukose, noch mit Insulin die IL-6 mRNA Expression und die IL-6 Sekretion in Monozyten induzierte bzw. supprimierte.

Hingegen sank die IL-6 Plasmakonzentration 2 h nach oraler Glukosebelastung signifikant ab. Die Reduktion an proinflammatorischem IL-6 im Plasma 2 h nach oraler Glukoseaufnahme könnte die These unterstützen, dass Insulin antiinflammatorische Effekte aufweist [42]. Die mRNA von IL-6 wird aber nicht reguliert, was gegen einen Einfluss von Glukose oder Insulin auf NF-κB spricht. Die Reduktion des IL-6 im Plasma ist jedoch nicht auf eine veränderte Synthese in den Monozyten zurückzuführen.

Denkbar wären eine verringerte Synthese bzw. ein erhöhter Abbau des Plasma IL-6.

Da jedoch IL-6 von vielen Geweben freigesetzt wird, ist es zum jetzigen Zeitpunkt nicht möglich, genauere Aussagen zu machen.

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4.1.2 Orale Glukoseaufnahme induziert die SOD2 mRNA, während das intrazelluläre Protein nicht reguliert wird

Während die SOD2 Genexpression in Monozyten im OGTT induziert wurde, blieb die SOD2 Proteinkonzentration 2 h nach oraler Glukoseaufnahme unverändert. Auch die Stimulation primärer Monozyten oder THP-1 Zellen mit Glukose und Insulin in vitro über 2 h führte zu keiner Veränderung der intrazellulären Konzentration von SOD2.

Postprandiale Hyperglykämien führen nachweislich zu einer vermehrten Produktion an ROS in der Zelle [60], was wiederum die SOD2 stimuliert, die die Zelle vor oxidativem Stress schützt [61]. In dieser Arbeit konnte somit bestätigt werden, dass die Genexpression an SOD2 durch orale Glukosebelastung bzw. postprandiale Hyperglykämien induziert wird, wobei dies nicht zu einer Induktion des Proteins führt.

4.1.3 Das Chemokin IL-8

4.1.3.1 Insulin stimuliert das Chemokin IL-8 (CXCL8) in humanen Monozyten über den MAP-Kinase-Signalweg

Die IL-8 mRNA Expression in Monozyten insulinsensitiver Probanden wurde 2 h nach oraler Glukoseaufnahme induziert. Die intrazelluläre IL-8 Konzentration primärer Monozyten war jedoch nach 2 h im OGTT unverändert. Um die verschiedenen Effekte von Glukose und Insulin differenzieren zu können, wurden Monozyten in vitro mit Glukose und/oder Insulin stimuliert. Während unter Glukosestimulation keine Veränderungen eintraten, wurde nach einer 2-stündigen Inkubation mit Insulin sowohl die IL-8 mRNA als auch die IL-8 Sekretion in die Überstände induziert.

Chronisch erhöhte Glukosespiegel von bis zu 25 mM erhöhen beim Diabetiker die IL-8 Konzentration im Plasma und die Monozytenadhäsion an Endothelzellen [62, 63]. Jedoch liegen bisher noch keine Studien über den Einfluss oraler Glukoseaufnahme auf IL-8 im Monozyten vor. In dieser Arbeit wurden die Monozyten für in vitro Untersuchungen mit 5 mM Glukose stimuliert, was dem Blutzuckerspiegel insulinsensitiver Probanden entspricht [64]. Nach einer Inkubation über 2 h konnte keine veränderte IL-8 Konzentration festgestellt werde. Hingegen induzierte Insulin, das antiinflammatorisch wirken sollte [65], die IL-8 Sekretion humaner Monozyten in vitro.

Neben der oben erwähnten Monozytenadhäsion an Endothelzellen induziert IL-8 auch die Chemotaxis von Neutrophilen zum Entzündungsherd [66]. In jungen, insulinsensitiven Probanden erhöhte sich 2 h nach oraler Glukoseaufnahme die Anzahl neutrophiler Granulozyten um 28 % [67].

Um den Signalweg zu identifizieren, über den Insulin IL-8 und dessen Sekretion induziert, wurden primäre Monozyten mit Insulin und verschiedenen Inhibitoren des Insulinsignalwegs stimuliert. Während sowohl unter dem PI3-Kinase-Inhibitor Wortmannin als auch unter dem mTOR-Inhibitor Rapamycin die durch Insulin stimulierte IL-8 Induktion anhielt, hob der MEK-Inhibitor PD98059 diese auf. In Monozyten insulinsensitiver Probanden stimuliert demnach Insulin das Chemokin IL-8 über den MAP-Kinase-Signalweg.

4.1.3.2 Die orale Glukoseaufnahme reduziert die IL-8 Plasmakonzentration in insulinsensitiven Probanden

Obwohl die intrazelluläre IL-8 Konzentration in Monozyten nach oraler Glukosebelastung anstieg und die IL-8 Sekretion humaner Monozyten durch Insulin in vitro stimuliert wurde, fand man im OGTT nach 2 h erniedrigte IL-8 Plasmawerte.

Dies stimmt mit der Studie von Oostrom et al. überein, in der die IL-8 Konzentrationen 1 h nach Glukoseaufnahme zwar ansteigen, 2 h danach jedoch wieder abnehmen [67].

Jedoch konnte in anderen Studien gezeigt werden, dass in übergewichtigen Probanden mit gestörter Glukosetoleranz (IGT), deren systemische IL-8 Konzentrationen im Vergleich zu Normalgewichtigen bereits erhöht sind, nach oraler Glukosebelastung das IL-8 im Plasma weiter ansteigt [64, 68]. Auch bei insulinsensitiven Probanden steigt die IL-8 Sekretion postprandial an, jedoch geringer als bei Patienten mit herabgesetzter Glukosetoleranz (IGT). Diese IL-8 Induktion durch postprandial erhöhtes Insulin bei Patienten mit IGT könnte über den MAP-Kinase-Weg ablaufen, der bei eben diesen Patienten noch nicht gestört ist [69].

Sowohl eine Insulin stimulierte Synthese als auch ein verminderter Abbau von IL-8 könnten zum postprandialen Anstieg der IL-8 Plasmakonzentration führen. Jedoch kann dadurch noch nicht erklärt werden, wodurch der Unterschied zwischen den verschiedenen Studien zustande kommt: Während von Straczkowski et al. eine Induktion der postprandialen IL-8 Sekretion bei insulinsensitiven Probanden publiziert wird, sinkt die IL-8 Plasmakonzentration in dieser Arbeit bei jungen, gesunden Spendern 2 h nach oraler Glukoseaufnahme ab. Eine mögliche Ursache für diese

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unterschiedlichen Ergebnisse könnte in den anthropometrischen Daten der

„insulinsensitiven Spendergruppen“ liegen: Während bei Straczkowski et al. das Durchschnittsalter der glukosetoleranten Probanden 41 ± 12 Jahre betrug und deren Ernährungszustand gemäß einem BMI von 34 ± 3 bereits als adipös einzustufen war, waren die Spender in dieser Arbeit mit einem Altersdurchschnitt von 22 ± 1 wesentlich jünger und lagen mit einem BMI von 22,5 ± 2 im Normbereich. Da IL-8 positiv mit dem Alter und dem BMI korreliert, könnten die unterschiedlichen anthropometrischen Daten zumindest teilweise die Diskrepanz zwischen den verschiedenen postprandialen IL-8 Konzentrationen erklären.

Darüber hinaus konnte auch in dieser Arbeit bei zwei der 20 Probanden ein postprandialer Anstieg der IL-8 Plasmakonzentration beobachtet werden, welcher jedoch nicht begründet werden kann, da sich diese Probanden hinsichtlich Alter, BMI und Insulinsensitivität nicht vom Rest des Spenderkollektivs unterschieden.

4.1.4 Orale Glukoseaufnahme stimuliert intrazelluläres Resistin in humanen Monozyten, während die Plasmakonzentration unverändert bleibt Die Aktivierung von NF-κB durch Endotoxine und TNF führt zu einer Induktion der Genexpression und der Sekretion von Resistin in humanen Monozyten [70].

2 h nach oraler Glukosebelastung insulinsensitiver Probanden konnte eine erhöhte intrazelluläre Resistinkonzentration im Monozyten festgestellt werden. Durch eine Insulinstimulation von THP-1 Zellen in vitro wurde ebenfalls eine Induktion des intrazellulären Resistins hervorgerufen, was vermuten lässt, dass Insulin der Grund für den intrazellulären Resistinanstieg im Monozyten ist. Es fiel jedoch auf, dass die intrazelluläre Resistinkonzentration in THP-1 Zellen wesentlich niedriger war als die im humanen Monozyten.

Hyperresistinämie erhöht bei Mäusen sowohl die Blutzucker- als auch die Insulinspiegel, während man unter Resistinmangel niedrige Glukosekonzentrationen im Plasma findet [51]. Des Weiteren führen erhöhte Resistinspiegel in Mäusen zu Dyslipidämie, wozu ein erhöhtes Gesamtcholesterin, erhöhte Triglyzeride und verminderte HDL-Konzentrationen zählen [71]. Obwohl diese Ergebnisse zeigen, dass Resistin auf den Glukose- und Lipidstoffwechsel von Nagetieren störend einwirkt, bleibt seine Rolle beim Menschen weiterhin unklar. Bisher konnte noch kein Zusammenhang zwischen dem zirkulierenden Resistin und der humanen Glukosehomöostase hergestellt werden. Die systemischen Resistinkonzentrationen

gesunder Kontrollen erwiesen sich sogar signifikant höher als die von Patienten mit Diabetes mellitus Typ I bzw. Typ II [72]. Jedoch zeigen Patienten im frühen Stadium der Koronaren Herzkrankheit (KHK) erhöhte systemische Resistinspiegel auf [73].

Die proatherogenen Eigenschaften des Resistins wurden auch von Xu W. et al.

nachgewiesen: So nehmen Makrophagen unter Hyperresistinämie mehr modifiziertes LDL auf (oxLDL) und exprimieren zugleich vermehrt CD36 mRNA [74]. In dieser Arbeit konnte 2 h nach oraler Glukosebelastung keine veränderte CD36 Genexpression im Monozyten festgestellt werden, obwohl die intrazelluläre Resistinkonzentration im OGTT anstieg.

Während 2 h nach oraler Glukoseaufnahme die intrazelluläre Resistinkonzentration in Monozyten gesunder Spender durch Insulin anstieg, wurde die mRNA Expression nicht induziert. Es liegt daher nahe, dass sich Insulin positiv auf die Resistinsynthese und/oder –stabilität auswirkt. Darüber hinaus könnte eine verminderte Sekretion zu erhöhten intrazellulären Resistinkonzentrationen führen, was jedoch in dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte: Weder die Resistinkonzentration im Plasma der OGTT-Teilnehmer, noch die in den Überständen Insulin stimulierter THP-1 Zellen bzw. Monozyten sank nach 2 h ab, sondern blieb vielmehr konstant. Auch in Patientinnen mit PCOS konnte 2 h nach oraler Glukosebelastung keine veränderte Resistinkonzentration im Plasma beobachtet werden [75].

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4.2 Der Einfluss von Glukose und Insulin auf Gene des Lipid- und Glukosestoffwechsels

4.2.1 Das Adipozytokin Adiponektin und seine Rezeptoren AdipoR1 und AdipoR2

4.2.1.1 Orale Glukosebelastung induziert die AdipoR1 Genexpression im Monozyten, während die AdipoR2 mRNA unverändert bleibt

Adiponektin ist ein antidiabetisch und antiatherogen wirksames Hormon, das von Adipozyten synthetisiert wird. Es greift an den Adiponektinrezeptoren 1 und 2 an (AdipoR1 und R2) und erhöht so die Fettsäureoxidation und die Glukoseaufnahme in peripherem Gewebe [76], indem es die S6K1 vermittelte Serin-Phosphorylierung am IRS-1 hemmt und somit den Insulinsignalweg induziert [77].

Die mRNA Expression der beiden Adiponektinrezeptoren AdipoR1 und R2 steigt bei Mäusen nach 48-stündiger Nahrungskarenz in Skelettmuskel- und Leberzellen an und wird nach erneuter Nahrungsaufnahme inhibiert. Auch in vitro fällt die Genexpression nach Insulinstimulation ab. Dies weist darauf hin, dass der postprandiale Adiponektineffekt auf der Rezeptorebene reguliert wird [76].

In dieser Arbeit wurde die Genexpression der Adiponektinrezeptoren 1 und 2 im Monozyten 2 h nach oraler Glukosebelastung analysiert: Während die AdipoR1 mRNA 2 h nach Glukoseaufnahme induziert wurde, blieb die AdipoR2 mRNA unverändert. In vitro konnte hingegen bei THP-1 Zellen durch Insulin und/oder Glukose bei keinem der Rezeptoren eine Induktion der Genexpression beobachtet werden.

Es ist bereits bekannt, dass die Expression der AdipoR1 mRNA im Makrophagen im Gegensatz zur AdipoR2 mRNA erhöht ist [78]. Dies erklärt jedoch noch nicht, weshalb nach oraler Glukosebelastung nur die AdipoR1 mRNA, nicht aber die AdipoR2 mRNA induziert wird. Es sollten weitere Versuche ex vivo erfolgen, auch auf Proteinebene, die dies nochmals aufgreifen.

4.2.1.2 Die Adiponektinkonzentration im Plasma wird durch orale Glukoseaufnahme nicht beeinflusst

Während das Adiponektin im Plasma bei Patientinnen mit polyzystischen Ovarien (PCO) im OGTT 2 h nach Glukoseaufnahme signifikant ansteigt [75], bleibt es sowohl bei gesunden, bei glukoseintoleranten Patienten und auch bei Typ II Diabetikern 2 h nach Glukoseaufnahme gleich [75, 79]. In dieser Arbeit wurde das Plasmaadiponektin und dessen Verlauf im OGTT bei jungen, insulinsensitiven Probanden bestimmt, wobei auch hier 2 h nach Glukosegabe keine signifikante Konzentrationsänderung des Adiponektins im Plasma zu beobachten war.

Jedoch zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den basalen Adiponektinspiegeln von Männern und Frauen: Die durchschittliche Adiponektinkonzentration im Plasma vor Glukoseaufnahme war bei den weiblichen Spenderinnen etwa doppelt so hoch als bei den männlichen Probanden. Dieses Ergebnis ist mit anderen Studien vereinbar, in denen dieser geschlechtsspezifische Unterschied bereits gezeigt wurde [80]. Da Adiponektin sowohl antidiabetische als auch antiatherogene und antiinflammatorische Effekte aufweist [75], leitet sich daher womöglich auch das erhöhte Risiko von Männern ab, an Diabetes und Arteriosklerose zu erkranken.

4.2.2 Orale Glukoseaufnahme supprimiert die Flotillin-1 Genexpression und beeinflusst die Flotillin-1 Proteinmenge in humanen Monozyten

Es wurde schon lange vermutet, dass an der Insulin stimulierten Glukoseaufnahme über GLUT4 in die Zelle auch verschiedene Lipide beteiligt sind [81]. Von Baumann et al. wird ein zum PI3-Kinase-Weg alternativer Signalweg beschrieben, an dem unter anderem Flotillin-1 und Lipid Rafts beteiligt sein sollen [5] (s. auch Abbildung 1) und über den GLUT4 ebenfalls insulinabhängig transloziert wird.

Außerdem konnten Lipid Rafts und Flotillin-1 bereits auf monozytären Zelllinien (THP-1 Zellen) nachgewiesen werden [82]. Da jedoch bisher noch keine Daten über den Einfluss oraler Glukoseaufnahme auf die Flotillin-1 Expression im humanen Monozyten publiziert wurden, griff man dies in der vorliegenden Arbeit auf.

Im Rahmen dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Genexpression von Flotillin-1 in humanen Monozyten 2 h nach Glukoseaufnahme reduziert ist. Hingegen verringerte sich die Flotillin-1 Proteinmenge nur bei vier der zehn Spender. Bei fünf

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Probanden konnte 2 h nach oraler Glukosebelastung eine größere Proteinmenge an intrazellulärem Flotillin-1 detektiert werden, während bei einem Spender kein Flotillin-1 nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse werfen einige Fragen auf und sind nur zum Teil mit bereits existenten Studien vereinbar: Fecchi et al.

untersuchten die insulinabhängige Glukoseaufnahme in die Skelettmuskelzelle [83].

Hierbei wurde vermutet, dass die Glukoseaufnahme durch GLUT4 über zwei zeitlich voneinander getrennt ablaufende Signalwege reguliert wird: Dem PI3K-Weg (2 min nach Insulinstimulation) und dem Weg über Lipid Rafts und Flotillin-1 (5 min nach Insulinstimulation), wobei die intrazelluläre Flotillin-1 Menge vor und nach Insulinstimulation unverändert blieb. Insulin stimulierte die Translokation von Flotillin-1 von perinuklear zur Plasmamembran, woraus ein relativer Anstieg von Flotillin-1 an der Plasmamembran und somit am Wirkort resultierte. Außerdem wurden von Fecchi et al. nur Daten max. 20 min nach Insulinstimulation erhoben.

Daher sollten weitere Untersuchungen folgen, die die Auswirkungen von Insulin auf Flotillin-1 nach 2 h sowohl in vitro als auch in vivo näher analysieren.

Durch Flotillin-1 siRNA konnte gezeigt werden, dass die GLUT4 Translokation über Lipid Rafts im Muskel unter Flotillin-1 Mangel reduziert ist [83]. Daher sollten auch in humanen Monozyten Untersuchungen mit Flotillin-1 siRNA durchgeführt werden, um die Rolle des Flotillin-1 in der Insulin stimulierten Glukoseaufnahme in den Monozyten besser einordnen zu können.

4.2.3 Orale Glukosebelastung induziert die ApoE mRNA im Monozyten und verringert die ApoE Plasmakonzentration

Apolipoprotein E (ApoE) ist ein multifunktionales Protein, das von der Leber und anderen peripheren Zellen, u.a. den Makrophagen, produziert wird [84]. Es wirkt antiatherogen, indem es eine entscheidende Rolle im reversen Cholesterintransport, im Lipoproteinmetabolismus und in der Immunantwort spielt [84]. ApoE-Knockout-Mäuse (ApoE^-/-) weisen bereits nach 10 Wochen schwerwiegende arteriosklerotische Läsionen auf [85]. Andererseits reduziert die makrophagenspezifische ApoE Expression arteriosklerotische Herde in ApoE^-/- Mäusen [86]. Die ApoE Expression aus Makrophagen wird durch verschiedene Faktoren reguliert, wozu auch das Insulin zählt: Insulin reduziert sowohl die ApoE mRNA als auch die ApoE Sekretion in humanen hepatozytären Zelllinien (HepG2) in vitro. Jedoch wurde der Einfluss von

Insulin auf die ApoE Expression und Sekretion bisher weder in Adipozyten noch in Monozyten analysiert.

In dieser Arbeit wurde der Einfluss oraler Glukoseaufnahme auf die monozytäre ApoE Expression und die Plasmakonzentration an ApoE untersucht: Die Genexpression von ApoE wurde 2 h nach oraler Glukosebelastung induziert, während die intrazelluläre Proteinmenge sowohl in Monozyten ex vivo als auch in Monozyten in vitro nach Glukose- bzw. Insulinstimulation im Immunoblot unverändert blieb.

Die ApoE Plasmakonzentration sank 2 h nach oraler Glukosebelastung ab.

Betrachtet man Männer und Frauen getrennt, so sinkt der ApoE Plasmaspiegel nur bei Männern, nicht aber bei den weiblichen Probanden.

Ob nun ApoE aus Monozyten, Adipozyten oder Hepatozyten diesen geschlechtsspezifischen Effekt im Plasma bedingt, muss in weiteren Untersuchungen abgeklärt werden.

4.2.4 Orale Glukosebelastung induziert die Genexpression von ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1)

Wie ApoE, so ist auch der ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) am reversen Cholesterintransport beteiligt: ABCA1 wird in der Leber und in Makrophagen exprimiert und spielt eine Rolle beim Transfer von Cholesterin und Phospholipiden von peripheren Zellen zum lipidarmen Apolipoprotein A1, was wiederum zur Bildung von HDL-Partikeln führt [87].

In dieser Arbeit wurde ABCA1 im Monozyten auf mRNA Ebene untersucht: 2 h nach oraler Glukosebelastung zeigte sich eine signifikante Induktion der ABCA1 Genexpression in humanen Monozyten. Insulin supprimiert hingegen die ABCA1 mRNA sowohl in primären Hepatozyten der Ratte als auch in HepG2- und THP-1- Zelllinien in vitro [87].

Es fällt auf, dass Insulin die Genexpression einiger am reversen Cholesterintransport beteiligter Mediatoren (ApoE, ABCA1) im Monozyten induziert, während es diese in der Leber supprimiert. Weitere ex vivo Versuche sollten durchgeführt werden, um die Regulation von ApoE und ABCA1 im Monozyten zu klären.

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4.3 Der Einfluss von Glukose und Insulin auf die Plasmakonzentrationen