Einfluss der Nahrungsmittelextrakte auf die mögliche Entwicklung einer kardialen Fibrose und zelluläre, morphologische Veränderungen

4.2.5 Einfluss der Nahrungsmittelextrakte auf die mögliche Entwicklung einer kardialen

Matrixmetalloproteinasen

WT Zellen Mmp2 Mmp9 Mmp13 Mmp14

Std. BKE BL BKE BL BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 100 100 100 100

4 71 ± 12 88 ± 22 119 ± 21 508 ± 101 195 ± 20 * 136 ± 24 77 ± 10 109 ± 11 6 79 ± 6 134 ± 31 127 ± 17 316 ± 22 215 ± 42 114 ± 15 96 ± 32 94 ± 14 18 118 ± 32 144 ± 16 124 ± 22 150 ± 15 207 ± 57 122 ± 29 89 ± 7 115 ± 7 32 105 ± 37 161 ± 14 142 ± 46 187 ± 56 202 ± 70 134 ± 31 77 ± 14 127 ± 6 64 121 ± 41 125 ± 28 35 ± 10 * 59 ± 18 147 ± 26 130 ± 32 78 ± 11 139 ± 15

RAGE KO Mmp2 Mmp9 Mmp13 Mmp14

Std. BKE BL BKE BL BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 100 100 100 100

4 84 ± 6 104 ± 9 144 ± 19 350 ± 48 207 ± 99 352 ± 142 111 ± 21 123 ± 20 6 78 ± 28 108 ± 6 235 ± 66 444 ± 68 172 ± 91 308 ± 122 108 ± 17 100 ± 15 18 98 ± 4 118 ± 2 131 ± 51 267 ± 6 * 144 ± 63 151 ± 60 104 ± 10 88 ± 10 32 134 ± 37 143 ± 9 96 ± 57 316 ± 79 191 ± 105 186 ± 46 144 ± 44 124 ± 19 64 113 ± 22 122 ± 9 159 ± 96 161 ± 4 * 144 ± 44 154 ± 28 100 ± 9 83 ± 11

Tabelle 4.6 b: Darstellung der Expressionsanalysen der Matrixmetalloproteinasen. Hierbei erfolgte die Durchführung wie in Tabelle 4.6a angegeben.

Das mRNA Niveau der TIMPs wurde bei der BKE/BL-Behandlung unterschiedlich reguliert. Die Timp1 zeigte bei beiden Extrakten und Zelllinien eine signifikant vermehrte Expression nach 4 Std., die bis zu 18 Std. anhielt, aber das Signifikanzniveau nicht immer erreichte. Das mRNA Niveau der Timp2 sowie Timp3 wurde durch die BKE/BL-Stimulation bei beiden Zelllinien nicht beeinflusst. Die gewonnenen RT-PCR Daten der WT Zellen stimmen nur begrenzt mit den cDNA-Microarray Analysen überein. Hier konnte eine nur schwach vermehrte Timp1 Expression nachgewiesen werden, wohingegen Timp2, -3 beide vermindert exprimiert wurden.

tissue inhibitors of matrixmetalloproteinases

WT Zellen Timp1 Timp2 Timp3

Std. BKE BL BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 100 100

4 549 ± 63 ** 897 ± 96 * 91 ± 10 10 ± 15 98 ± 9 121 ± 5 6 664 ± 145 * 862 ± 107 * 111 ± 12 87 ± 4 88 ± 20 112 ± 12 18 578 ± 78 ** 393 ± 139 119 ± 19 108 ± 4 75 ± 11 101± 6 32 357 ± 111 379 ± 116 108 ± 20 112 ± 6 74± 7 * 132 ± 28 64 176 ± 37 170 ± 56 101 ± 17 99 ± 11 68 ± 6 * 123 ± 13

RAGE KO Timp1 Timp2 Timp3

Std. BKE BL BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 100 100

4 761 ± 151 * 604 ± 115 * 82 ± 6 105 ± 19 74 ± 9 100 ± 13 6 773 ± 152 * 702 ± 164 93 ± 10 103 ± 5 95 ± 14 90 ± 4 18 404 ± 139 323 ± 198 91 ± 8 95 ± 7 80 ± 5 * 90 ± 1 32 220 ± 118 213 ± 112 99 ± 23 125 ± 14 102 ± 36 110 ± 8 64 117 ± 22 160 ± 48 93 ± 7 113 ± 19 99 ± 20 104 ± 10

Tabelle 4.6 c: Darstellung der Expressionsanalysen der tissue inhibitors of matrix metalloproteinases.

Hierbei erfolgte die Durchführung wie in Tabelle 4.6a angegeben.

Bei der Analyse des Einflusses der BL-Behandlung auf die EZM-Proteine zeigte sich, dass über den analysierten Zeitraum von 4 bis 64 Std. das mRNA-Expressionsniveau der Prokollagene (Col1a1, Col3a1, Col4a1) sowie des Lamb2 und Fbln5 beider Zelllinien nicht verändert wurde.

Diese Daten entsprechen bis auf die Fbln5 Expression (signifikant verminderte Expression) jenen, die mittels cDNA-Microarray Analyse gefunden wurden. Andere Effekte wurden bei der Verwendung des Gesamtextraktes erzielt. Hier führte diese Behandlung bei den WT Zellen langfristig (nach 64 Std.) zu einer verminderten mRNA-Expression von Col1a1, Col3a1 und Fbln5. Die mRNA-Expression des Col4a1 sowie des Lamb2 wurde hingegen nicht verändert. Bei

den RAGE KO Zellen konnte eine verminderte mRNA-Expression nach 64 Std. nur für das Col3a1 gefunden werden. Alle anderen Gene wie Col1a1, Col4a1, Lamb2 und Fbln5 zeigten kein verändertes Expressionsniveau.

Kollagene und EZM Proteine

WT Zellen Col1a1 Col3a1 Col4a1 Lamb2 Fbln5

Std. BKE BL BKE BL BKE BL BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

4 68 ± 12 89 ± 5 71 ± 24 78 ± 20 176 ± 39 178 ± 37 112 ± 5 131 ± 27 71 ± 10 * 115 ± 12 6 117 ± 9 114 ± 20 70 ± 24 72 ± 18 158 ± 30 173 ± 20 124 ± 25 102 ± 6 60 ± 11 ** 97 ± 4 18 70 ± 4 * 108 ± 10 90 ± 4 97 ± 6 158 ± 49 110 ± 11 103 ± 30 120 ± 13 41 ± 3 * 122 ± 20 32 68 ± 13 105 ± 15 76 ± 9 87 ± 21 115 ± 27 138 ± 26 99 ± 21 108 ± 9 52 ± 10 * 130 ± 11 64 53 ± 4 * 100 ± 8 43 ±9 * 76 ± 14 68 ± 22 146 ± 45 95 ± 15 103 ± 2 68 ± 6 * 125 ± 19

RAGE KO Col1a1 Col3a1 Col4a1 Lamb2 Fbln5

Std. BKE BL BKE BL BKE BL BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

4 114 ± 24 94 ± 7 103 ± 32 90 ± 21 113 ± 9 132 ± 22 88 ± 5 100 ± 17 85 ± 10 89 ± 25 6 81 ± 23 106 ± 7 109 ± 17 74 ± 21 127 ± 13 130 ± 16 110 ± 16 103 ± 8 80 ± 6 93 ± 12 18 76 ± 8 87 ± 6 94 ± 13 76 ± 13 120 ± 15 103 ± 11 102 ± 2 92 ± 10 68 ± 16 91 ± 19 32 117 ± 29 113 ± 15 103 ± 22 104 ± 33 155 ± 48 137 ± 14 115 ± 33 109 ± 5 78 ± 19 112 ± 28 64 85 ± 23 106 ± 1 74 ± 6 * 138 ± 79 124 ± 7 133 ± 43 113 ± 23 105 ± 11 82 ± 25 136 ± 38

Tabelle 4.6 d: Darstellung der Expressionsanalysen der EZM-Proteine (Prokollagene, Laminine, Fibuline). Hierbei erfolgte die Durchführung wie in Tabelle 4.6a angegeben.

RT-PCR Analysen der zeitabhängigen BKE-Stimulation beider Zelllinien führten zu einer kurzfristigen aber nicht signifikanten Induktion der Myofibroblastenmarker Acta2 sowie Tpm1 (4 Std.), welche jedoch langfristig (nach 64 Std.) deutlich und signifikant unter das Kontrollniveau sanken. Diese Effekte konnten mit der löslichen Brotkrustenfraktion nicht beobachtet werden. Nur bei den WT Zellen sank die Tpm1 mRNA-Expression nach 64 Std. signifikant unter das Kontrollniveau.

Myofibroblastenmarkergene

WT Zellen Acta2 Tpm1 RAGE KO Acta2 Tpm1

Std. BKE BL BKE BL Std. BKE BL BKE BL

0 100 100 100 100 0 100 100 100 100

4 503 ± 147 154 ± 17 144 ± 15 103 ± 2 4 157 ± 65 119 ± 12 95 ± 3 113 ± 12 6 433 ± 131 106 ± 17 114 ± 9 78 ± 10 6 143 ± 42 104 ± 10 103 ± 3 88 ± 4

18 48 ± 11 * 101 ± 7 88 ± 9 78 ± 9 18 53 ± 10 * 84 ± 5 83 ± 9 98 ± 3

32 94 ± 28 94 ± 18 89 ± 15 87 ± 12 32 125 ± 51 132 ± 6 86 ± 20 97 ± 4

64 39 ± 31 * 101 ± 25 70 ± 6 * 85 ± 4 * 64 63 ± 2 * 82 ± 20 77 ± 5 * 94 ± 16

Tabelle 4.6 e: Darstellung der Expressionsanalysen der Myofibroblasten assoziierten Genmarker.

Hierbei erfolgte die Durchführung wie in Tabelle 4.6a angegeben.

Einfluss des Kaffeeextraktes auf Fibrose assoziierte Genmarker: Analysen des Einflusses des Kaffeeextraktes auf die Entwicklung einer kardialen Fibrose wurden durch konzentrations-abhängige Untersuchungen an WT Zellen (24 Std.) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die unterschiedlichen KE-Konzentrationen zu keiner Veränderung der Expression der verschiedenen Tgf-β Isoformen führten.

transforming growth factor

WT Tgf-β1 Tgf-β2 Tgf-β3 KE (mg/ml)

0 100 100 100

0,01 128 ± 4 93 ± 16 91 ± 6 0,03 125 ± 7 96 ± 10 100 ± 5

0,1 114 ± 7 94 ± 10 94 ± 2 0,3 121 ± 11 95 ± 7 99 ± 3 0,8 148 ±9 * 108 ± 19 94 ± 9

Tabelle 4.7.a: Darstellung der Expressionsanalysen des transforming growth factors β Konfluente unter Serumreduktion kultivierte WT Zellen wurden für mit den angegebenen KE-Konzentrationen für 24 Std. behandelt und anschließend RNA isoliert. Die aufgelisteten Gene wurden durch RT-PCR Analyse quantifiziert und auf 18 S rRNA normalisiert, wobei die unbehandelten Kontrollzellen auf 100 % normiert wurden. (MWaller Experimente ± SEM, n = 3, *P

≤ 0,05 vs. unbehandelte Kontrolle; **P ≤ 0,01 vs.

unbehandelte Kontrolle).

Die MMP mRNA-Expression hingegen wurden differentiell reguliert. Besonders bei den höheren Konzentrationen (KE: 0,8 mg/ml) wurde eine signifikant verminderte mRNA-Expression der Mmp2 und Mmp14 gefunden. Das Expressionsniveau der Mmp13 wurde durch keine der verwendeten KE-Konzentrationen beeinflusst, wohingegen die Mmp9 mRNA bei allen Konzentrationen eindeutig signifikant vermindert wurde.Die Inhibitoren der MMPs - die TIMPs – wurden durch die KE-Behandlung nicht verändert reguliert.

Matrixmetalloproteinasen tissue inhibitors of matrixmetalloproteinases

WT Mmp2 Mmp9 Mmp13 Mmp14 Timp1 Timp2 Timp3

KE (mg/ml)

0 100 100 100 100 100 100 100

0,01 93 ± 19 22 ± 10* 96 ± ⁸ 120 ± 18 85 ± ¹⁶ 89 ± ¹⁰ 96 ± ¹¹ 0,03 89 ± ¹⁶ 18 ± 6 ** 88 ± ⁵ 101 ± ¹² 101 ± ⁸ 91 ± ¹² 94 ± ⁰ 0,1 98 ± 18 23 ± 13 * 99 ± ⁴ 97 ± 19 97 ± ¹⁸ 93 ± ² 80 ± ⁹ 0,3 97 ± 22 37 ± 18 * 92 ± ¹ 84 ± 14 117 ± ²³ 87 ± ¹⁸ 93 ± ¹³ 0,8 55 ± 8 * 21 ± 3** 105 ± ¹⁵ 60 ± 3 ** 147 ± ⁸⁷ 93 ± ²³ 94 ± ¹⁹

Tabelle 4.7 b: Darstellung der Expressionsanalysen der Matrixmetalloproteinasen und der tissue inhibitors of metalloproteinases Hierbei erfolgte die Durchführung wie in Tabelle 4.7a angegeben.

Die mRNA-Expression der EZM-Proteine wie Lamb2, Fbln5 und Col4a1 wurden durch die Behandlung mit dem AGE-reichen KE-Extrakt nicht verändert reguliert. Bei Col1a1 sowie Col3a1 wurde bei hohen KE-Konzentrationen ein vermindertes mRNA-Niveau der beiden Gene gefunden.

Analysen der beiden Myofibroblastenmarkergene zeigten keine veränderte Expression dieser Gene bei KE-Behandlung.

Kollagene und EZM Proteine Myofibroblastenmarkergene

WT Col1a1 Col3a1 Col4a1 Lamb2 Fbln5 Acta2 Tpm1

KE (mg/ml)

0 100 100 100 100 100 100 100

0,01 100 ± 14 69 ±11 204 ± 85 96 ± 9 91 ± 8 96 ± 4 96 ± 5

0,03 94 ± ³ 93 ±¹⁴ 201 ± ⁷² 104 ± ³ 103 ± ¹⁷ 90 ± ¹² 98 ± ¹³ 0,1 78 ±10 77 ± 21 90 ± 51 105 ± 1 114 ± 11 88 ± 12 95 ± 9 0,3 80 ± 4 * 88 ±16 212 ± 100 105 ± 5 118 ± 4 95 ± 15 96 ± 10

0,8 60 ± 3 ** 32 ±7 * 151 ± ⁵⁶ 95 ± ¹³ 90 ± ¹¹ 48 ± 8 * 126 ± ¹²

Tabelle 4.7 c: Darstellung der Expressionsanalysen der EZM-Proteine und Myofibroblastenmarker.

Hierbei erfolgte die Durchführung wie in Tabelle 4.7a angegeben.

Die allgemeine verminderte mRNA Genexpression bei der höchsten KE-Konzentration von 0,8 mg/ml ist relativ überraschend und mag eventuell mit dem allgemein toxischen Potential des KE korrelieren. Allerdings zeigte sich auch, dass besonders die MMPs (besonders die MMP9) in ihrer mRNA-Expression unter KE-Behandlung vermindert wurden. Um zu analysieren, ob dies auch einen Einfluss auf die Aktivität dieser Enzyme ausübt, wurden Zymographien mit unterschiedlichen KE-Konzentrationen an konfluenten unter Serumreduktion kultivierten WT-Zellen durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass zymographisch nur die Aktivität der MMP2 (~66 kDa) bestimmt werden konnte, deren Aktivität ab einer Konzentration von 0,1 mg/ml vermindert wurde. Eine Veränderung der MMP2-Aktivität durch die BKE-Behandlung der Zelllinie wurde nicht gefunden.

Abb. 4.26: Analyse des Einflusses des KE/BKE-Extraktes auf die MMP2-Aktivität der WT Zelllinie Konfluente unter Serumreduktion kultivierte WT Zellen wurden mit den angegebenen KE-/BKE-Konzentrationen stimuliert, nach 24 Std. der Zellkulturüberstand abgenommen und die Zellzahl zu jeder Probe bestimmt. Die MMP2-Aktivität wurde durch Zymographie analysiert, wobei die unbehandelten Kontrollen auf 100 % normiert wurden. (MWaller Experimente ± SEM; n = 5 (KE); n = 2 (BKE) *P ≤ 0,05 vs.

unbehandelte Kontrollzellen).

4.2.6 Analyse des Einflusses der AGE-reichen Brotkrustenfraktionen auf die vermehrte

Im Dokument Der Einfluss von "Advanced Glycation Endproduct" - reichen Nahrungsmittelextrakten auf die Funktion kardialer Fibroblasten (Seite 66-70)