dass die Cas-1-Zellen auf diesem Wege ihre EGFRvIII-Expression und möglicherweise auch ihre EGFR-Genamplifikation verloren haben, so dass eine erneute Re-Expression auch unter den hier verwendeten serumfreien Kulturbedingungen nicht möglich war. Diese Annahme wurde durch Analysen bestätigt, die im Rahmen einer Kooperation mit dem Hans Dietrich Hermann Labor für Hirntumorbiologie am UKE durchgeführt worden sind.
Hierbei konnte mittels EGFR-spezifischer PCR (Polymerase Chain Reaction) in den Cas-1 Zellen keine EGFR-Genamplifikation nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Darüber hinaus konnten mittels durchflusszytometrischer Analyse lediglich 2,6%
(s. Abb. 4.3) EGFRvIII+-Zellen in der Cas-1-Population detektiert werden.
Zusammenfassend zeigen die Daten, dass eine EGFRvIII-Expression nicht mit einer erhöhten Radioresistenz assoziiert ist und Zellen mit endogener EGFRvIII-Expression im Vergleich zu EGFRvIII-negativen Zellen sogar strahlenempfindlicher sind.
5.2 Einfluss des EGFRvIII auf eine EGFR-Inhibition
Im Rahmen dieser Analysen wurde deutlich, dass Gefitinib-Konzentrationen, die unter Therapie im Tumor erzielt werden können, weder in EGFRvIII−- noch in EGFRvIII+-Zellen zu einer robusten Zellinaktivierung mit und ohne Bestrahlung führten und eine EGFRvIII-Expression somit keinen Einfluss auf das EGFR targeting zu haben scheint.
Einen deutlichen Effekt erzielte die Gefitinib-Behandlung auf die Signalweiterleitung in BS153vIII−-Zellen, da hier die AKT-Phosphorylierung deutlich inhibiert und die ERK1/2-Phosphorylierung sogar vollständig unterdrückt wurde. Dies resultierte in einer nahezu vollständigen Wachstumsinhibition der BS153vIII−-Zellen. In den BS153vIII+-Zellen, die nach Gefitinib-Behandlung kaum eine Reduktion ihrer AKT- bzw. ERK1/2-Phoshporylierung zeigten, bewirkte die Gefitinib-Behandlung wie erwartet nur eine geringe Wachstumsverzögerung (s. Abb. 4.10 A+B). Dies bestätigt zunächst die Annahme, dass der EGFRvIII eine Resistenz gegenüber Gefitinib hinsichtlich der Zellproliferation vermittelt. In Fibroblasten führte die EGFRvIII-Expression ebenfalls zu einer erhöhten Resistenz gegenüber Gefitinib und EGFRvIII-exprimierende Zellen wurden durch die Gefitinib-Behandlung weniger stark in ihrer Proliferation gehemmt, als Zellen, die den EGFRvIII nicht exprimierten [155]. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Gefitinib-Behandlung die Invasion EGFRvIII-exprimierender Zellen nicht hemmen konnte, während die Invasionsrate von EGFR-Wildtyp exprimierenden Zellen reduziert war [154].
Dass der EGFRvIII ein genereller Marker für die Resistenz gegenüber Tyrosin-kinaseinhibitoren ist, konnte im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit jedoch nicht bestätigt werden, da sowohl in den DKMGvIII−- als auch in den DKMGvIII+-Zellen lediglich eine leichte Reduktion der ERK1/2-Phosphorylierung detektiert werden konnte.
Hierbei führte Gefitinib zu einer geringen Wachtumsverzögerung der DKMGvIII+-Zellen, während die Behandlung keinen Einfluss auf das Wachstum von DKMGvIII−-Zellen hatte (s. Abb. 4.10 B).
Eine mögliche Erklärung dafür, dass die AKT- und ERK1/2-Aktivierung in BS153vIII−-Zellen im Vergleich zu den anderen Sub-Zelllinien nach Gefitinib-Behandlung stärker inhibiert wurde, könnte in der niedrigeren EGFR-Expression begründet liegen (s. Abb. 4.10 A). Möglicherweise reicht hier die Gefitinib-Konzentration aus, um die geringere Anzahl an EGFR-Molekülen in ihrer Aktivität zu inhibieren. Darüber hinaus ist bekannt, dass Gefitinib auch HER2 inhibieren kann, welcher ebenfalls die Aktivität von AKT- und ERK1/2 reguliert [156]. Im Hinblick auf die Klonogenität zeigte sich, dass eine
Gefitinib-Behandlung von 24 h keinen zytotoxischen Effekt auf die DKMGvIII−/+- und BS153vIII−/+-Zellen hatte.
In den hier vorliegenden Versuchen wurde eine relativ niedrige Gefitinib-Konzentration von 5 µM verwendet. Die hier beobachteten geringen Effekte sind aber im Einklang mit bereits publizierten Daten von Schulte et al. zu sehen. In dieser prä-klinischen Studie wurden BS153-Zellen, die eine heterogene EGFRvIII-Expression aufwiesen mit 25 µM Gefitinib behandelt und es konnte hierbei nur eine Reduktion der AKT- und nicht der MAPK-Phosphorylierung beobachten werden [146]. Trotz der schwachen Effekte wurde die Gefitinib-Konzentration nicht weiter erhöht, da es sich bei 5 µM um die Konzentration handelt, die im Gehirn eines Patienten unter Therapie erreicht wird [157].
Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse an, dass Gefitinib-Konzentrationen, die unter Therapie im Gehirn von GBM-Patienten erreichbar sind, nicht zu einer effektiven Zellinaktivierung von EGFRvIII−- und EGFRvIII+-Zellen führen, obwohl sich die Sub-Zelllinien in ihrem Ansprechen auf die EGFR-Inhibition hinsichtlich der Signaltransduktion und der Proliferation deutlich unterscheiden.
Um zu überprüfen, ob Gefitinib einen Einfluss auf die DSB-Reparatur der DKMGvIII−/+- und BS153vIII−/+-Sub-Zelllinien hat, wurden residuelle γH2AX/53BP1-Foci nach Gefitinib-Behandlung und Bestrahlung analysiert. In diesem Zusammenhang konnten Kriegs et al. zeigen, dass eine Inhibition des EGFR-Signalweges zu einer verminderten DNA-Reparaturkapazität führen kann, was wiederum über den MAPK-Signalweg vermittelt wird [62].
Da wie im vorherigem Abschnitt beschrieben in den DKMGvIII−/+-Zellen keine Inhibition der AKT- sowie ERK1/2-Phosphorylierung beobachtet werden konnte, wäre zu erwarten, dass sich auch kein Unterschied in der Anzahl residueller Reparaturfoci nach Gefitinib-Behandlung und Bestrahlung zeigt. Überraschenderweise wiesen jedoch die DKMGvIII+-Zellen signifikant mehr residuelle Foci im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle auf, während für die DKMGvIII−-Zellen nach Gefitinib-Behandlung und Bestrahlung kein Anstieg beobachtet werden konnte (s. Abb. 4.12 A). Die BS153vIII−-Zellen zeigten nach Gefitinib-Behandlung einen starken Anstieg residueller γH2AX/53BP1-Foci, welcher somit vermutlich auf die vollständige Inhibition der ERK1/2-Phosphorylierung zurückzuführen war (s. Abb. 4.10 A). Die Beobachtung, dass BS153vIII+-Zellen keinen Anstieg residueller DSB-Foci zeigten, stehen im Einklang mit
den Signaltransduktions-Daten aus Abb. 4.11 A. Hier konnte kaum eine Beeinträchtigung der AKT- sowie ERK1/2-Aktivität beobachtet werden (s. Abb. 4.12 B).
Im Hinblick auf die Strahlenempfindlichkeit konnte außer für die DKMGvIII+-Zellen in keiner der Sub-Zelllinien eine Radiosensitivierung durch Gefitinib festgestellt werden (s. Abb. 4.13). Somit scheint auch eine deutliche Inhibition der EGFR-abhängigen Signalwege - wie für die BS153vIII−-Zellen beobachtet - oder ein Anstieg an residuellen Reparaturfoci nicht zwingend mit einer erhöhten Strahlenempfindlichkeit assoziiert zu sein.
Dies ist eine Beobachtung, die in mehreren aktuellen Projekten unabhängig von GBM-Zellen gemacht wurde, für die es aber bisher keine ausreichenden Literaturdaten oder Erklärungsmodelle gibt. Es ist anzunehmen, dass eine Inhibition der EGFR-abhängigen Signalwege somit nicht zwangsläufig zu einer schlechteren DNA-Reparatur, sondern eher zu einer Verzögerung der Reparatur oder zu einer Veränderung der Chromatinstruktur führt, so dass DNA-Reparaturkoplexe länger bestehen bleiben und diese somit mittels Immunfluoreszenz länger nachgewiesen werden können.
Interessanterweise konnten Mukherjee et al. eine Radiosensitivierung von EGFRvIII−- und EGFRvIII+-Zellen durch Gefitinib-Behandlung erzielen [40]. Allerdings wurde in dieser Studie auch eine durch den EGFRvIII vermittelte Radioresistenz beobachtet, was in der hier vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Daher liegen die beobachteten Diskrepanzen vermutlich an den verwendeten Modellsystemen, die sich grundlegend voneinander unterscheiden (vgl. Abschnitt 5.1).
Im Gegensatz zu den anderen EGFRvIII−/+-Sub-Zelllinien konnte in den DKMGvIII+- Zellen, die p53-Wildtyp exprimieren, eine Radiosensitivierung durch Gefitinib erreicht werden. Die Arbeiten von Kriegs et al., zeigen auf, dass Tumorzellen durch EGFR-Inhibitoren radiosensitiviert werden können, wenn sie einen intakten p53/p21-Signalweg aufweisen. Die erhöhte zelluläre Strahlenempfindlichkeit nach EGFR-Inhibition beruht in Zellen, die p53-Wildtyp exprimieren auf einem transienten G1-Arrest, der durch Re-Platierung (delayed plating) wieder aufgehoben werden kann. Um zu überprüfen, ob es sich bei der beobachteten Radiosensitivierung in DKMGvIII+-Zellen ebenfalls um einen reversiblen Zellzyklusarrest handelt, wurden daher Koloniebildungstests unter delayed plating Bedingungen durchgeführt [136]. Unter diesen Bedingungen zeigte sich keine erhöhte Strahlenempfindlichkeit von DKMGvIII+-Zellen nach EGFR-Inhibition mehr. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass die unter pre-plating Bedingungen beobachtete Radiosensitivierung reversibel ist und somit nicht auf eine verminderte DNA-Reparaturkapazität, sondern auf einen transienten G1-Arrest zurückzuführen war (s. Abb.
4.12 A). Da BS153-Zellen p53 mutiert sind, könnte sich trotz starker Inhibition der AKT- sowie ERK1/2-Aktivierung in BS153vIII−-Zellen die fehlende Radiosensitivierung erklären.
Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass unter Therapie erzielbare Gefitinib-Konzentrationen weder in EGFRvIII−- noch in EGFRvIII+-Zellen zu einer robusten Zellinaktivierung mit und ohne Bestrahlung führten und eine EGFRvIII-Expression somit keinen Einfluss auf das EGFR-targeting zu haben scheint. Dies ist in Einklang mit aktuellen klinischen Studien zu sehen, die ebenfalls kein deutliches Ansprechen von GBM-Patienten auf Tyrosinkinaseinhibitoren feststellen konnten.