Um eine mögliche modulierende Wirkung der CLA-Supplementierung auf die Immunpolarisierung beim Rind zu untersuchen, wurde die Konzentration beider IgG-Isotypen im Blu- und Milchserum mittels sandwich Elisa bestimmt. Nach Titrationsversuchen zur Ermittlung der optimalen optischen Dichten (ODs) bei niedrigen Hintergrundwerten wurde eine Konzentration von 1 µg/ml für die capture-Antikörper und von 0,05 µg/ml für die Detektionsantikörper (gilt für IgG1 und IgG2), ausgewählt. Die idealen Serum-Verdünnungen, bei denen einen optimale Abstufung der ODs zu erkennen war lagen für Blutserumproben zwischen 3,16 x 10-5 und 1 x 10-7, und für Milchserumproben zwischen 1 x10-3 und 3,16 x10-4.
4.3.1 Eine CLA-Supplementierung reduziert den Gehalt beider IgG-Isotypen im Blutserum
Während die Kontrollgruppe und die CLA-50 Gruppe einen kontinuierlichen Anstieg der Konzentration beider IgG-Isotypen ab Tag 7 p.p. aufwiesen (p<0,01), war bei der CLA-100 Gruppe nur ein schwacher (p>0,05) Anstieg zu sehen. Somit lag sie im Abschnitt von Tag 7 p.p.(
eine Woche nach Beginn der Zufütterung) bis Tag 196 p.p.(zwei Wochen nach CLA-Absetzen) mit den IgG1- und IgG2-Konzentrationen unter den Werten der Kontrollgruppe und der CLA-50 Gruppe. Dieser Unterschied war zwischen der CLA-100 Gruppe und der Kontrollgruppe zu allen Zeitpunkten, mit Ausnahme vom Tag 70 p.p. für IgG1 und von den Tagen 49, 70 und 140 p.p. für IgG2 signifikant gesichert (p<0,05). Die Werte der CLA-50 Gruppe verliefen parallel zu den Werten der Kontrollgruppe, lagen allerdings über den Werten der CLA-100 Gruppe, was nur zu einigen Tagen signifikant war (p<0,05). Nach dem Absetzen von CLA waren die IgG1- und IgG2-Konzentrationen der CLA-100 Gruppe mit den Werten anderer zwei Gruppen wieder vergleichbar (p>0,05). Der allgemeine Abfall der Konzentration beider IgG-Isotypen in den Seren der CLA 100-Gruppe führte zu IgG1/IgG2-Verhältnissen, die sich im gesamten Verlauf von den Verhältnissen der anderen Gruppen nicht unterschieden (Abb.
18).
Ergebnisse
Abb. 18: Einfluss der CLA-Supplementierung auf IgG-Isotypen-Konzentrationen sowie auf das Verhältnis IgG1/IgG2 im Serum.
CLA wurde ab dem Tag der Abkalbung (Tag 0) dem Futter der CLA-Gruppen (jede Gruppe n=16) in zwei Dosen (CLA-50 und CLA-100) zugesetzt und ab dem Tag 182 abgesetzt. Der Kontrollgruppe (n=17) wurde das gleiche Futter, jedoch ohne Zusatz von CLA, angeboten. IgG-Isotyp-Konzentrationen (A,B) wurden in den gewonnenen Serumproben mittels Elisa bestimmt.C) Verhältnis zwischen IgG1 und IgG2.
-21 -14 -7 0 7 14 21 35 49 70 105 140 182 189 196 210 224 238 252
Ig G1 m g /m l Ig G2 m g /m l Ig G1 / Ig G2
Ergebnisse
4.3.2 Eine CLA-Supplementierung reduziert die Konzentration an Milch-IgG1, jedoch nicht IgG2
Ab dem Tag 14 nach der Abkalbung fiel die Konzentration beider IgG-Isotypen kontinuierlich in der Milch aller drei Gruppen ab. Während alle drei Gruppen einen gleichmäßigen Abfall an Serum-IgG2 zeigten, war der Abfall an Milch-IgG1 bei der CLA-100 Gruppe stärker als bei den anderen beiden Gruppen zu sehen, sodass diese Gruppe zu den Tagen 49, 70, 105, 140 (p<0,05) und 182 (p=0,06) p.p. IgG1-Konzentrationen in der Milch aufwies, die unter den Werten der Kontrollgruppe lagen. Im Vergleich zu der CLA-50 Gruppe waren die Werte nur an Tag 70 p.p.
signifikant niedriger (p<0,05). In der Zeit nach dem Absetzen der Supplementierung waren die Werte der einzelnen Gruppen wieder vergleichbar (p>0,05). Während des gesamten Verlaufs waren die IgG1/IgG2-Verhältnisse aller drei Gruppen miteinander vergleichbar ohne signifikante Einflüsse durch CLA-Supplementierung bzw. nach CLA-Absetzen zu sehen (p>0,05) (Abb. 19).
Eine mögliche lineare Korrelation zwischen der Konzentration der IgG-Isotypen im Blut und ihren Konzentrationen in der Milch wurde anhand des Korrelationskoeffizienten nach Pearson überprüft. Während sich eine positive (r = 0,55) signifikante (p< 0,0001) Korrelation zwischen der IgG1-Konzentration im Serum und der im Milchserum an Tag 14 p.p. ergab, zeigte die IgG2-Konzentration im Blutserum keinen signifikanten Zusammenhang mit der im Milchserum (p = 0,6). Für IgG1 war die Korrelation zu den meisten untersuchten Zeitpunkten signifikant (p <
0,01), IgG2 zeigte hingegen zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Korrelation (p > 0,05).
Ergebnisse
Abb. 19: Einfluss der CLA-Supplementierung auf IgG-Isotypen-Konzentrationen sowie auf das Verhältnis IgG1/IgG2 im Milchserum.
CLA wurde ab dem Tag der Abkalbung (Tag 0) zum Futter der CLA-Gruppen (jede Gruppe n=16) in zwei Dosen (CLA-50 und CLA-100) zugesetzt und ab Tag 182 abgesetzt. Der Kontrollgruppe (n=17) wurde das gleiche Futter, jedoch ohne Zusatz von CLA, angeboten. IgG-Isotyp-Konzentrationen (A,B) wurden in den gewonnenen Milchproben bei allen Tieren mittels Elisa bestimmt. C) Verhältnis zwischen IgG1 und IgG2.
Ig G1 m g /m l Ig G2 m g /m l Ig G1 / Ig G2
A
B
C
Ergebnisse
4.4 Einfluss der CLA-Supplementierung auf die absolute Zellzusammensetzung des peripheren Blutes
Um zu prüfen, ob die durch die relative Quantifizierung nachgewiesenen Wirkungen der CLA-Supplementierung auf die Zellzusammensetzung des Blutes (4.1) sich auch in unterschiedlichen absoluten Werten äußern, erfolgte in einem zweiten Fütterungsversuch - basierend auf den Ergebnissen des ersten Fütterungsversuchs - ab dem Tag der Abkalbung eine Supplementation mit 100 g CLA pro Tier und Tag. Um die absoluten Zellzahlen von Granulozyten und mononukleären Zellen im Blut zu bestimmen, wurden zuerst ihre prozentualen Anteile an den Gesamtleukozyten (nach der Entfernung von Erythrozyten) durchflusszytometrisch erfasst. Für die weitere Charakterisierung der MNC-Populationen wurde die Membranimmunfluoreszenz (3.2.5) durchgeführt. Die ermittelten relativen Zellzahlen wurden mit den absoluten Blut-Leukozytenzahlen verrechnet. Blut-Leukozytenzahlen wurden freundlicherweise von der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
-21 -14 -7 -3 1 7 14 21
D) Monozyten E) B-Zellen F) T-Zellen
Ergebnisse
Abb. 20: Einfluss der CLA-Supplementation auf die absolute Anzahl von Leukozyten, Granulozyten und mononukleären Zellen im Blut.
CLA wurde ab dem ersten Tag nach der Abkalbung (Tag 1 p.p.) und bis Tag 21 p.p. angeboten. Die absolute Anzahl von (A) Leukozyten, (B) Granulozyten, (C) MNC, (D) Monozyten, (E) B-Zellen und (F) T-Zellen im Blut ist als das Hundertfache an Zellen pro µL Blut dargestellt.
Eine CLA-Supplementierung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die absoluten Zahlen der Gesamtleukozyten, Granulozyten, MNC, Monozyten, B-Zellen und T-Zellen im Blut (Abb. 20).
Die CLA-Gabe führte zu einem deutlichen Rückgang der absoluten Anzahl an CD4 positiven -T-Zellen, was, wie im ersten Versuch, zu demselben Zeitpunkt nach Beginn der CLA-Supplementierung auftrat. Bei der CLA-100 Gruppe fiel die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen stark und signifikant von Tag 14 p.p. (8,2 ± 0,7 x102/µL) bis Tag 21 p.p. (5,4 ± 0,4 x102/µL) ab (p<0,01) und lag unter dem Mittelwert (p=0,07) der Kontrollgruppe (7,3 ± 0,9 x102/µL). Die untersuchten Gruppen zeigten keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf die Anzahl CD8-positiver -T-Zellen, -T-Zellen oder auf das CD4/CD8-Verhältnis (p>0,05) (Abb. 21).
-21 -14 -7 -3 1 7 14 21
Ergebnisse
Abb. 21: Der Einfluss von CLA auf die absolute Anzahl von CD4+, CD8+ Zellen und
-T-Zellen.
CLA wurde ab dem ersten Tag nach der Abkalbung (Tag 1 p.p.) und bis Tag 21 p.p. angeboten. Die absolute Anzahl von CD4+ T-Zellen (A), CD8+ T-Zellen (B), -T-Zellen (D) (x102/µL) sowie das Verhältnis CD4/CD8 (C) ist dargestellt.