Effekte von Milchsäure auf die LPS-induzierte Genexpression

Da die Analyse der Wirkung von Milchsäure auf Monozyten vor dem Hintergrund eines inflammatorischen Milieus, das in vielen Tumoren zu finden ist [101], stattfand, erfolgte auch die Untersuchung der Genexpression unter inflammatorischen Bedingungen. Hierzu wurden frisch isolierte Monozyten nur mit LPS bzw. mit LPS in Kombination mit Milchsäure, Natriumlaktat oder entsprechender Ansäuerung sowohl für eine, als auch für vier Stunden inkubiert. Als Kontrollen dienten frisch isolierte Monozyten ohne Inkubation bzw. für eine oder vier Stunden ohne LPS-Stimulation inkubierte Monozyten. Unmittelbar nach der Aufreinigung der Monozyten aus dem Blut sowie nach Ablauf der verschiedenen Inkubationszeiten, wurde RNA aus den Zellen isoliert und nach Fluoreszenzmarkierung auf RNA-Expressionsarrays hybridisiert (siehe 4.3.4). Die erhaltenen Rohdaten wurden anschließend, wie in Kapitel 4.3.4.3 erläutert, ausgewertet. Bei der Auswertung der RNA-Expressionsarrays wurde deutlich, dass Milchsäure überwiegend negative Effekte auf die LPS-induzierte Genexpression hat. Der stärkste Einfluss der Milchsäure auf die Genexpression lag dabei nach der einstündigen Inkubationsphase vor. Weiterhin zeigte sich, dass viele der durch Milchsäure beeinflussten Gene auch durch alleinige Ansäuerung beeinflusst wurden (Daten nicht gezeigt).

Aus diesem Grund konzentrierte sich die Auswertung der Array-Daten auf die Suche nach Genen, die nach einer einstündigen Inkubation einen mindestens zweifachen Unterschied in der Expression zwischen den ohne und den mit LPS inkubierten Zellen zeigten. Da vor allem Effekte der Milchsäure und nicht Effekte der Ansäuerung interessierten, wurde als weiteres Suchkriterium ein ebenfalls mindestens zweifacher Unterschied in der Expression der für eine Stunde mit 20 mM Milchsäure und der mit entsprechender Ansäuerung inkubierten Zellen angelegt. Im Rahmen dieser Suche wurden 193 Gene gefunden und unsupervidiert hierarchisch geclustert (Abbildung 5-28). Eine Liste dieser Gene mit ausgeschriebenen Gennamen befindet sich im Anhang dieser Arbeit (siehe Tabelle 9-1).

Erwartungsgemäß zeigten die in der hierarchischen Clusteranalyse enthaltenen Gene eine nach einer Stunde durch LPS induzierte Expression. Bei Inkubation mit LPS in Kombination mit 20 mM Milchsäure war bei einem Großteil der durch LPS-induzierten Gene nach einer Stunde eine deutlich geringere Genexpression zu finden. Dabei zeigte die Genexpression dieser Zellen eine größere Ähnlichkeit zu dem Niveau der ohne LPS inkubierten bzw. nicht inkubierten Zellen.

Abbildung 5-28: Hierarchische Clusteranalyse der durch LPS und Milchsäure beeinflussten Gene

Frisch isolierte Monozyten wurden für eine und vier Stunden mit 100 ng/ml LPS, 10 bzw. 20 mM Milchsäure (MS), Ansäuerung (pH 7,1 (eine Stunde); pH 6,6) oder 20 mM Natriumlaktat (NaL) inkubiert. Als Kontrolle (Ko) dienten frisch isolierte (0h) sowie für eine bzw. vier Stunden inkubierte Monozyten. Die Farben stehen für mindestens fünffache Herunter- (dunkelblau) oder Hochregulation (dunkelrot) der Genexpression. Der Baum zeigt Ähnlichkeiten in der Genexpression der unterschiedlichen Ansätze. Die in der rechten Spalte rot markierten Gene wurden per RT-qPCR verifiziert. Die Daten wurden aus vier unabhängigen Spendern (zweimal je eine Stunde, zweimal je 4 Stunden) gewonnen. Fortsetzung der Abbildung siehe nächste Seite.

Fortsetzung von Abbildung 5-28 (Seite 94)

Dies spiegelt sich auch in der Position wider, die die mit LPS und 20 mM Milchsäure behandelte Probe innerhalb des in Abbildung 5-28A/B gezeigten „Ähnlichkeitsbaumes“

einnimmt: Die mit 20 mM Milchsäure und LPS behandelte Probe zeigt große Ähnlichkeit zu den Proben, die nicht mit LPS behandelt bzw. nicht inkubiert wurden. Auch nach einer einstündigen Inkubation mit LPS bei pH 6,6 war bei einem Teil der LPS-induzierten Gene keine Induktion der Genexpression festzustellen. Verglichen mit den mit 20 mM Milchsäure inkubierten Zellen lag der Effekt jedoch bei einer deutlich geringeren Zahl von Genen vor und war schwächer ausgeprägt. Im Gegensatz dazu war bei einstündiger Inkubation mit LPS und 10 mM Milchsäure, Kulturmedium mit pH 7,1 oder Natriumlaktat kein wesentlicher Unterschied zu den nur mit LPS inkubierten Monozyten erkennbar.

Nach vier Stunden zeigten die mit LPS inkubierten Zellen im Vergleich zur Genexpression nach einer Stunde eine teils reduzierte, induzierte oder unveränderte Expression. Bei den für vier Stunden mit LPS und 20 mM Milchsäure inkubierten Monozyten war der überwiegend negative Einfluss der Milchsäure auf die Genexpression nicht mehr vorhanden. Ein großer Teil der Gene zeigte nun eine ähnliche Expression wie nach vierstündiger Inkubation mit LPS. Teilweise war im Vergleich zur Inkubation mit LPS noch immer eine reduzierte, bei manchen Genen auch eine verstärkte Expression festzustellen.

Auch die nach einer Stunde aufgetretenen Effekte der Ansäuerung waren nach vier Stunden meist nicht mehr erkennbar. Dies zeigt, dass es sich bei dem negativen Effekt der Milchsäure (und der entsprechenden Ansäuerung) auf die LPS-induzierte Genexpression überwiegend um einen transienten Effekt handelte, der die LPS-Induktion nicht ausschaltet, sondern verzögert. Wie in Kapitel 5.2.2.3.3 gezeigt, wurden aber auch länger anhaltende Effekte der Milchsäure gefunden.

5.2.2.3.2 „Gene Ontology“-Analyse der regulierten Gene

Die Datenbank „Gene Ontology“ (www.geneontology.org) bietet ein standardisiertes Vokabular zur Beschreibung der Funktion von Genprodukten im zellulären Kontext (sogenannte „Gene Ontology“ (GO)-Begriffe). Um zu analysieren, welche zellulären Funktionen von Monozyten stark durch Milchsäure beeinflusst werden, wurde nach einer signifikanten Anreicherung von GO-Begriffen innerhalb der in der Clusteranalyse enthal-tenen Gene gesucht (siehe auch 4.3.4.3). Tabelle 5-2 zeigt einige dieser signifikant angereichertern GO-Begriffe. Die vollständige Liste der (teils redundanten) GO-Begriffe mit den zugehörigen Definitionen befindet sich im Anhang dieser Arbeit (siehe Tabelle 9-2).

Tabelle 5-2: Signifikant angereicherte „Gene Ontology“-Begriffe

Extrazellularraum 9,96 x 10^-12 35 468

Zytokinaktivität 1,21 x 10^-11 24 152

Reaktion auf

Verwundung 3,98 x 10^-09 28 362

Immunantwort 1,04 x 10^-07 26 520

Stressantwort 2,48 x 10^-06 33 1086

Rezeptorbindung 4,83 x 10^-05 24 668

Chemokinaktivität 8,64 x 10^-05 12 44

Regulation eines biologischen

Prozesses

3,72 x 10^-03 61 6327

programmierter Zelltod 4,52 x 10^-03 11 374

Regulation der

Zellkommunikation 9,00 x 10^-03 1 252

Proteinbindung 9,13 x 10^-03 61 6156

Regulation der

biologischen Qualität 1,40 x 10^-02 11 836

Reaktion auf virale

Stimulation 1,85 x 10^-02 6 76

vaskuläre Entwicklung 2,06 x 10^-02 2 112

Regulation eines

zellulären Prozesses 2,86 x 10^-02 61 5843

fBenjamini-Yekutieli-Korrektur (siehe 4.3.4.3); ^g*P<5 x 10^-2, **P<1 x 10^-2, ***P<1 x 10^-3