3. Material und Methoden
3.2. Methoden
3.2.1. in vitro Versuche
3.2.1.5. Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorting) FACS) . 51
Die gewünschte Zellzahl wurde in ein FACS Röhrchen überführt und mit 3 ml FACS-Puffer für 5 Min bei 450 g gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und ein Blockierung der Fc-Rezeptoren anti-CD16/CD32 für 30 Min bei 4°C durchgeführt.
Im Anschluss erfolgte eine 30-minütige Inkubation mit spezifischen an Fluorochrome gekoppelten Antikörpern (in FACS-Puffer verdünnt) bei 4°C. Nach der Inkubation wurden die Proben mit 3 ml FACS-Puffer gewaschen. Die durchflusszytometrische Messung erfolgte am FACS Canto II der Firma BD Biosciences. Beim Einsatz mehrerer Antikörper wurden vor der Messung Settings aufgenommen um störende spektrale Überlappungen der Fluorochrome auszugleichen. Die Auswertung der ermittelten Daten erfolgte mit FlowJo.
3.2.1.6. Molekularbiologische Methoden 3.2.1.6.1. RNA-Isolation aus Zellen
Die RNA wurde mittels des Quick-RNA™ MiniPrep Kits der Firma Zymo Research isoliert. Alle Aufreinigungsschritte fanden bei RT statt. Dazu wurden die Zellen bei 330 g 6 Min zentrifugiert und der Überstand verworfen und das Pellet mit 300 µl Lysepuffer je 5x106 Zellen resuspendiert. Das Lysat wurde auf eine Spin-Away Säule gegeben und bei 16.000 g für eine Minute zentrifugiert. Dieser Schritt diente der Entfernung genomischer RNA aus der Probe. Im Anschluss wurde das gereinigte Lysat 1:2 mit 98%igem Ethanol versetzt, auf eine Zymo-Spin IIICG-Säule gegeben und für 30 Sekunden (Sek) bei 16.000 g zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen. Es folgte ein Waschschritt mit 400 µl Prep-Puffer mit einer Zentrifugation von 16.000 g für 30 Sek. Nachfolgend wurde die Säule zwei Mal mit Waschpuffer gewaschen und abermals zentrifugiert, wobei im ersten Waschschritt mit 700 µl Waschpuffer und 30 Sek bei 16.000 g und im zweiten Durchgang mit 400 µl für 2 Min ebenfalls bei 16.000 g zentrifugiert wurde. Anschließend wurde die Säule in ein RNase freies 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, 35 µl RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert und wurde bei 21.000 g zentrifugiert. Dieser Elutionsschritt wurde einmal wiederholt um die Ausbeute an RNA zu erhöhen. Die isolierten RNA-Proben wurden bei -20°C aufbewahrt.
Material und Methoden 52
3.2.1.6.2. Qualitative und quantitative Analyse von RNA
Nach erfolgter Isolierung wurde die Konzentration der RNA mit Hilfe des Nano-Drops der Firma Fischer Scientific Inc. photometrisch bestimmt. Dazu wurde 1 µl der RNA in das Gerät pipettiert und die Konzentration bei 260 nm gemessen. Zur Überprüfung der Reinheit wurde das Verhältnis 260/230 nm (Aussage über Lösemittel im Eluat) sowie 260/280 nm (Aussage über Proteinkontamination im Eluat) ermittelt.
Die Qualität der RNA wurde mittels Gelelektrophorese mit einem 1%igen Agarosegel kontrolliert.
3.2.1.6.3. Agarosegelelektrophorese
Die RNA sowie PCR-Amplifikate wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Dazu wurden 0,7 – 2%ige Agarosegele verwendet. Dazu wurde die benötigte Menge Agarose in 1x TAE-Puffer gelöst und in der Mikrowelle aufgekocht. Nach dem Abkühlen auf 60°C wurde der Mischung Ethidiumbromid mit einer Endkonzentration von 1 µg/ml hinzugegeben. Die Agarose wurde in einen Schlitten mit einem Kamm für die späteren Kammern gegossen. Nach dem Erhärten wurde das Gel samt Schlitten in die Gelkammer, welche 1x TAE-Puffer enthielt, überführt. Die Proben wurden mit 5 µl 6x Orange G Ladepuffer gemischt und in die Taschen gegeben. Das Gel lief 30 Min bei 120-150 V bei 220 mA. Die Visualisierung der Banden erfolgte auf einem Bildschirm unter UV-Licht.
3.2.1.6.4. c-DNA-Synthese (Reverse Transkription)
Die Umschreibung von RNA in komplementäre DNA (cDNA) wurde mittels des iScript™ cDNA-Kits der Firma Bio-Rad durchgeführt. Dazu wurde das Volumen von bis zu 1 µg RNA zusammen mit 4 µl 5xiScript sowie 0,2 µl reverser Transkriptase gemischt.
Material und Methoden 53
Tab. 10: Komponenten für die c-DNA-Synthese
Reagenz Volumen [µl]
RNase freies H2O variabel
5x iScript reaction Mix 4
I Script reverse Transkriptase 0,2
RNA (max. 1 µg) variabel
Gesamtvolumen 20
Die reverse Transkription erfolgte im Thermo-Cycler bei folgendem Programm:
Tab. 11: Programm für die c-DNA-Synthese
Prozess Temperatur [°C] Dauer [Min]
Bindung der Oligonukleotide 25 5
cDNA-Synthese 42 30
Inaktivierung der reversen Transkriptase 85 5
Die cDNA-Proben wurden bei -20°C gelagert.
3.2.1.6.5. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Zur Etablierung von neuen Primern und zur Qualitätsüberprüfung der erzeugten cDNA vor dem Einsatz in einer quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR) wurde die PCR verwendet. Dabei wurden die gleichmäßige Expression des Housekeeping-Gens HPRT (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase) analysiert. Dafür wurde 1 µl cDNA mit sequenzspezifischen Primern, destilliertem Wasser, MgCl2-haltigem Puffer, Nukleotiden sowie Taq-Polymerase gemischt.
Material und Methoden 54
Tab. 12: Komponenten einer PCR-Reaktion
Reagenz Volumen [µl]
H2O 19,8
10x PCR-Puffer (mit 1,5 mM MgCl2) 2,5
dNTP 1
Primer-Mix 10 µM 0,5
Taq-Polymerase 0,2
cDNA 1
Gesamtvolumen 25
Die PCR wurde in einem Thermo-Cycler der Firma Eppendorf durchgeführt.
Tab. 13: PCR-Programm
Prozess Temperatur [°C] Dauer [Min]
Initiale Denaturierung 94 5
Denaturierung 94 1
Primeranlagerung 60 1 40x
Elongation 72 1
Finale Elongation 72 10
Lagerung 10
∞
Im Anschluss daran wurde die Integrität des Amplifikats durch eine Gelelektrophorese geprüft.
3.2.1.6.6. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Die Genexpression wurde mittels quantitativer Real-Time-PCR ermittelt, wobei in dieser Arbeit eine relative Quantifizierung stattfand. Unter relativer Quantifizierung
Material und Methoden 55
versteht man wie stark ein Gen in Bezug auf ein Referenz- bzw. Housekeeping-Gen exprimiert wird. Zur Berechnung der Genexpression wurde die ∆∆CT-Methode genutzt.
Dafür wurde die cDNA mit den folgenden Komponenten in eine 96-Loch Microplatte für PCR gegeben und mit einer transparenten Folie versiegelt.
Tab. 14: Komponenten für die qRT-PCR
Reagenz Volumen [µl]
H2O 11
SYBR Green PCR Mastermix 12,5
Primer-Mix 10 µM 0,5
cDNA 1
Gesamtvolumen 25
Für die Real-Time-PCR wurde der ABI7500 der Firma Applied Biosystems benutzt.
Dabei setzte sich die PCR-Reaktion aus folgenden Einzelschritten zusammen.
Tab. 15: qRT-PCR-Programm
Prozess Temperatur [°C] Dauer
Vorwärmen 50 2 Min
Aktivierung der Polymerase, erste Denaturierung
95 10 Min
Denaturierung 95 15 Sek
Primeranlagerung,
Elongation 60 1 Min 45x
95 15 Sek
Dissoziierungsschritt
(Schmelzkurve) 60 1 Min
95 15 Sek
Material und Methoden 56
Zur Berechnung der Expression bediente man sich der ∆∆CT-Methode. Dabei beschreibt der CT (Cycle Threshold)-Wert den Zyklus in dem die Signalstärke erstmals die Hintergrundfluoreszenz übersteigt und so den Beginn der exponentiellen Phase markiert. Bei der ∆∆CT-Methode wird zuerst der CT-Wert der endogenen Kontrolle von dem des Zielgens subtrahiert. Dieser ∆CT-Wert wird dann von dem
∆CT eines Kalibrators (Normgröße) abgezogen. Man erhält den ∆∆CT-Wert. Der quantitative Unterschied zwischen zwei Proben wurde dann nach der Formel 2-∆∆CT berechnet.
3.2.2. in vivo Versuche