Durchführung

Die Durchführung des ELISA-Tests verläuft in den Grundzügen für alle Interleukine gleich. Da sich jedoch Unterschiede bei Inkubationszeiten, Volumina und der Zugabe von Biotin-markierten Anti-IL ergeben, werden die Interleukine im Folgenden zur besseren Übersichtlichkeit einzeln betrachtet.

5.2.6.1 IL-15

Für den Versuch wurde eine Platte mit 12 Mikrotiterstreifen zu je acht Mikroküvetten verwendet. Für IL-15 wurden in die beiden ersten Streifen jeweils 100 μl der Standardlösung, in die restlichen Wells 50 μl Standardverdünnungspuffer sowie 50 μl der Probenflüssigkeit pipettiert.

Anschließend wurden jeweils 100 μl Biotin-markiertes Anti-IL-15 hinzugefügt, bevor die Platten mit einer Plastikfolie bedeckt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Um nicht-gebundene Antikörper aus den Mikroküvetten zu entfernen, musste die Platte nach der oben genannten Inkubationszeit gewaschen werden. Dazu wurde zunächst die Proben- und Standard-Flüssigkeit aus der Platte entleert, dann wurden alle Mikroküvetten der Platte viermal in Folge mit 0,4 ml verdünnter Waschlösung gefüllt und nach einer Einwirkungszeit von etwa 15 bis 30 Sekunden wieder entleert. Danach wurde die

Platte umgedreht und auf saugfähigem Fließpapier vorsichtig ausgeklopft, um Rückstände der Waschlösung vollständig zu entfernen.

Für den nächsten Schritt musste zunächst das 100-fach konzentrierte Streptavidin-HRP-Konzentrat mit einer HRP-Verdünnungslösung gemischt werden, bevor jeweils 100 μl dieser Meerrettichperoxidase-Lösung, welche für die Farbreaktion verantwortlich ist, in die Mikroküvetten pipettiert werden konnten. Die Platten wurden dann wieder mit Klebefolie abgedeckt und für 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden nach der vorgegebenen Inkubationszeit wie bereits oben beschrieben viermal gewaschen. Im Anschluss daran wurden 100 μl eines Chromogens in die Mikroküvetten pipettiert, wodurch die gewünschte blaue Farbreaktion hervorgerufen wurde. Die Platten wurden dann abgedeckt im Dunkeln inkubiert. Der Testlieferant Biosource schlug in der Testanleitung eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten vor, wies aber darauf hin, dass die Inkubationszeit je nach verfügbarem Photometer und dessen oberer Messgrenze für die OD auf 25 oder 20 Minuten verkürzt werden sollte. Beim Testansatz zur Bestimmung von IL-15 wurden die Platten deshalb nur 20 Minuten inkubiert, da nach diesem Zeitraum bereits eine starke Farbreaktion zu sehen war. Die Farbreaktion wurde dann durch die Zugabe von 100 μl Stopplösung pro Mikroküvette beendet und durch einen Farbumschlag von blau nach gelb sichtbar gemacht. Anschließend wurde die OD mittels Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 620 nm ermittelt.

5.2.6.2 IL-16

Für den Versuch wurde eine Platte mit 12 Mikrotiterstreifen zu je acht Mikroküvetten verwendet.

Zur Bestimmung von IL-16 wurden in die beiden ersten Streifen jeweils 100 μl der Standardlösung, in die restlichen Wells 50 μl Standardverdünnungspuffer sowie 50 μl der Probenflüssigkeit pipettiert. Anschließend wurden jeweils 100 μl Biotin-markiertes Anti-IL-16 hinzugefügt, bevor die Platte mit einer Plastikfolie bedeckt und drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Um nicht-gebundene Antikörper aus den Mikroküvetten der Platte zu entfernen, mussten die Platten nach der oben genannten Inkubationszeit gewaschen werden. Der Waschvorgang erfolgte analog dem Vorgang bei der Bestimmung von IL-15 oben. Für den nächsten Schritt musste zunächst das 100-fach konzentrierte Streptavidin-HRP-Konzentrat mit einer HRP-Verdünnungslösung gemischt werden, bevor jeweils 100 μl dieser Meerrettichperoxidase-Lösung, welche für die Farbreaktion verantwortlich ist, in die Mikroküvetten pipettiert werden konnten. Die Platten wurden dann wieder mit Klebefolie abgedeckt und für 30 Minuten inkubiert.

Die Platten wurden nach der vorgegebenen Inkubationszeit wie bereits oben beschrieben viermal gewaschen. Im Anschluss daran wurden 100 μl eines Chromogens in die Mikroküvetten pipettiert, wodurch die gewünschte blaue Farbreaktion hervorgerufen wurde. Die Platten wurden dann abgedeckt im Dunkeln inkubiert. Der Testlieferant Biosource schlug in der Testanleitung eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten vor, wies aber darauf hin, dass die Inkubationszeit je nach verfügbarem Photometer und dessen oberer Messgrenze für die OD auf 25 oder 20 Minuten verkürzt werden sollte. Beim Testansatz zur Bestimmung von IL-16 wurden die Platten jeweils 25 Minuten inkubiert, da nach diesem Zeitraum bereits eine starke Farbreaktion zu sehen war. Die Farbreaktion wurde dann durch die Zugabe von 100 μl Stopplösung pro Mikroküvette beendet und durch einen Farbumschlag von blau nach gelb sichtbar gemacht.

Anschließend wurde die OD mittels Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 620 nm ermittelt.

5.2.6.3 IL-18

Für den Versuch wurde eine Platte mit 12 Mikrotiterstreifen zu je acht Mikroküvetten verwendet.

Zur Bestimmung von IL-18 wurden zunächst 150 μl Standard und Proben in einer einfachen Platte angerichtet und dann aus dieser mit einer Multi-Channel-Pipette in die beschichtete ELISA-Platte umgefüllt, um auf diese Weise eine möglichst gleichlange Einwirkungszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur für alle Proben und den Standard zu erreichen. Der IL-18-Platte wurde zunächst kein Biotin-markiertes Anti-IL zugegeben. Um nicht-gebundene Antikörper aus den Mikroküvetten der Platte mit den Testansätzen zu entfernen, mussten die Platten nach der oben genannten Inkubationszeit gewaschen werden.

Das HRP-Konzentrat aus Anti-IL-18 und daran gebundene Meerrettichperoxidase für den IL-18 Testansatz war 101-fach konzentriert und musste entsprechend verdünnt werden, bevor auch hiervon jeweils 100 μl in die Mikroküvetten der IL-18 Platte gegeben und 60 Minuten inkubiert werden konnten.

Die Platten wurden nach der vorgeschriebenen Inkubationszeit, wie bereits oben beschrieben, viermal gewaschen. Im Anschluss daran wurden 100 μl eines Chromogens in die Mikroküvetten pipettiert, wodurch die gewünschte blaue Farbreaktion hervorgerufen wurde. Die Platten wurden dann abgedeckt im Dunkeln 30 min inkubiert. Die Farbreaktion wurde dann durch die Zugabe von 100 μl Stopplösung pro Mikroküvette beendet und durch einen Farbumschlag von blau nach gelb sichtbar gemacht. Anschließend wurde die OD mittels Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 620 nm ermittelt.