Druck- und Temperatur-Reversibilität der Effekte an Serum und

Eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von Hochdruck-NMR-Messungen spielt die Reversibilität der Druckeffekte nach Entfernen des Drucks auf die Probe.

Daher wurden im Rahmen der Hochdruckmessungen nach Druckerhöhung auf 𝑝 = 200 𝑀𝑃𝑎 1D-¹H-Spektren der Probe bei Normaldruck aufgenommen. Nach Tem-peratur- und Druckerhöhung wurden die Anfangsparameter wiederhergestellt, das heißt = 283 𝐾 und Normaldruck.

Bild 91: 1D ¹H-NMR-Spektren von Serum zur Kontrolle der Reversibilität der Druck- und Temperatureffekte bei T=283 K und Normaldruck. (a) zeigt die Differenz des Spektrums (d) und (b). Spektrum (b) wurde vor Beginn der Hochdruckmessreihe bei T=283 K und Normaldruck aufgenommen. Spektrum (c) zeigt das Messergebnis nach der ersten Druckreihe und Spektrum (d) das nach Temperaturerhöhung auf T=313 K, Druckerhöhung und anschließendem Wieder-herstellen der ursprünglichen Parameter. Das Signal „1“ bei etwa 1,17 ppm ist mit Hilfe von Spike-In-Experimenten dem Ethanol zuzuordnen. Ein weiteres Signal beisndet sich beim Cho-lin-Kopfgruppen-Signal bei etwa 3,2 ppm. Das Signal „2“ ist der Substanz Acetat zuzuordnen, welche Bestandteil des extrazellulären Puffers ist.

Die Ergebnisse dieser Messungen an Serum sind in Bild 91 dargestellt. Dabei ist in Bild 91 (a) das Spektrum bei Normaldruck und = 283 𝐾. Bild 91 (b) zeigt das Ergebnis der Messung nach Druckerhöhung und Entfernen des Drucks. In Bild 91 (c) ist die Mes-sung nach der Temperaturerhöhung auf = 313 𝐾, der Druckerhöhung und anschlie-ßendem Wiederherstellen der ursprünglichen Anfangsparameter ( = 283 𝐾 und Normaldruck) dargestellt.

Die Methyl- und Methylensignale weisen eine vollständige Druck- und Temperatur-Reversibilität auf. Dies gilt auch für die übrigen Signale des Spektrums. Von Bild 91 (b) zu (c) treten jedoch zusätzliche Signale bei etwa 𝛿 = 1,17 𝑝𝑝𝑚 und beim Cholin-Kopfgruppen-Signal bei etwa 𝛿 = 3,2 𝑝𝑝𝑚 auf. Da es sich dabei um relativ schmale Peaks handelt, kann man davon ausgehen, dass diese Signale niedermolekularen Sub-stanzen zuzuordnen sind. Der Triplett-Peak bei 𝛿 = 1,17 𝑝𝑝𝑚 kann mit Hilfe der Refe-Bild 92: 1D-¹H-NMR-Spektren von VLDL zur Kontrolle der Reversibilität der Druck- und Temperatureffekte bei T=283 K und Normaldruck. Spektrum (a) zeigt die Differenz des Spekt-rums (d) und (b). Spektrum (b) wurde vor Beginn der Hochdruckmessreihe bei T=283 K und Normaldruck aufgenommen. Spektrum (c) zeigt das Messergebnis nach der ersten Druckreihe und Spektrum (d) das nach Temperaturerhöhung auf T=313 K, Druckerhöhung und anschlie-ßendem Wiederherstellen der ursprünglichen Parameter. Das Signal „1“ tritt nach Tempera-tur- und Druckerhöhung auf und kann keiner Substanz zugeordnet werden.

renzspektren dem Ethanol zugeordnet werden. Die Ursache für das Auftreten des Ethanols nach Druckerhöhung ist, dass in den Leitungen der Hochdruckanlage mini-male Mengen an Ethanol vorhanden sind. Die Membran kann teilweise bei Drucker-höhung undicht werden. Daher ist eine geringe Konzentration von Ethanol detektier-bar.

Die Reversibilität von VLDL wird mit Hilfe der in Bild 92 gezeigten Spektren über-prüft. Die Auftragung der Spektren in dieser Abbildung wurde analog zu der in Bild 91 gewählt. Die Spektren sind trotz Temperatur- und Druckerhöhung nahezu vollstän-dig reversibel, jedoch tritt nach Temperatur- und Druckerhöhung bei etwa 𝛿 = 1,638 𝑝𝑝𝑚 ein Signal und bei 𝛿 = 0,853 𝑝𝑝𝑚 ein Nebenmaximum im Methylbereich auf. Dieser Druck- und/ oder Temperatureffekt verschwindet auch nach längerer Zeit (12 Stunden) und erneuter Messung der Probe nicht.

Bild 93: 1D-¹H-NMR-Spektren von IDL zur Kontrolle der Reversibilität der Druck- und Tem-peratureffekte bei T=283 K und Normaldruck. (a) zeigt die Differenz des Spektrums (d) und (b).

Spektrum (b) wurde vor Beginn der Hochdruckmessreihe bei T=283 K und Normaldruck aufge-nommen. Spektrum (c) zeigt das Messergebnis nach der ersten Druckreihe und Spektrum (d) das nach Temperaturerhöhung auf T=313 K, Druckerhöhung und anschließendem Wiederher-stellen der ursprünglichen Parameter.

Die Kontrollmessungen der IDL-Probe sind in Bild 93 dargestellt. Die Spektren sind trotz Temperatur- und Druckerhöhung nahezu vollständig reversibel, jedoch tritt nach Temperatur- und Druckerhöhung im Bereich des Cholin-Kopfgruppen-Signals ein zu-sätzlicher mit dem bei Serum vergleichbaren Peak auf. Das Ethanol-Signal bei 𝛿 = 1,17 𝑝𝑝𝑚 ist bei dieser Probe bereits bei Messbeginn sichtbar und scheint sich durch Temperatur- und Druckerhöhung zu verstärken. Die Druck- und Temperatureffekte der übrigen Signale sind vollständig reversibel.

Bild 94: 1D-¹H-NMR-Spektren von LDL zur Kontrolle der Reversibilität der Druck- und Temperatureffekte bei T=283 K und Normaldruck. (a) zeigt die Differenz des Spektrums (d) und (b). Spektrum (b) wurde vor Beginn der Hochdruckmessreihe bei T=283 K und Normaldruck aufgenommen. Spektrum (c) zeigt das Messergebnis nach der ersten Druckreihe und Spektrum (d) das nach Temperaturerhöhung auf T=313 K, Druckerhöhung und anschließendem Wieder-herstellen der ursprünglichen Parameter. Das Signal „1“ bei etwa 1,17 ppm ist mit Hilfe von Spike-In-Experimenten dem Ethanol zuzuordnen. Ein weiteres Signal beisndet sich beim Cho-lin-Kopfgruppen-Signal bei etwa 3,2 ppm. Das Signal „2“ ist der Substanz Acetat zuzuordnen, welche Bestandteil des extrazellulären Puffers ist.

In Bild 94 sind die Spektren der Messungen an LDL zur Überprüfung der Reversibilität Bild 95: 1D-¹H-NMR-Spektren von (a) HDL2 und (b) HDL3 zur Kontrolle der Reversibilität der Druck- und Temperatureffekte bei T=283 K und Normaldruck. Spektrum #1 zeigt die Diffe-renz des Spektrums (#4) und (#2). (#2) wurde vor Beginn der Hochdruckmessreihe bei T=283 K und Normaldruck aufgenommen. Spektrum (#3) zeigt das Messergebnis nach der ersten Druck-reihe und Spektrum (#4) das nach Temperaturerhöhung auf T=313 K, Druckerhöhung und anschließendem wiederherstellen der ursprünglichen Parameter. Das Signal „1“ ist der Sub-stanz Acetat zuzuordnen, welche Bestandteil des extrazellulären Puffers ist.

der Druck- und Temperatureffekte gezeigt. Die drei Spektren sind nahezu identisch bis auf das Ethanol-Signal bei etwa 𝛿 = 1,17 𝑝𝑝𝑚, welches nach Temperatur- und Druck-erhöhung zu erkennen ist

Um die Reversibilität der Druck- und Temperatureffekte beim HDL2 zu überprüfen, wurden die Spektren wie für die bisher gezeigten Lipoproteine und Serum in Bild 95 (a) aufgetragen. Hierbei sind die Spektren sowohl nach Druck- als auch nach Tempera-tur- und Druckerhöhung identisch. Jedes Signal nimmt wieder seine ursprüngliche Form an, was eine vollständige Druck- und Temperaturreversibilität bedeutet.

Analog zu HDL2 konnte ebenfalls die Reversibilität der Temperatur- und Druckeffekte bei HDL3 nachgewiesen werden. Die Spektren sind in Bild 95 (b) dargestellt und zei-gen keine Veränderunzei-gen, nachdem nach Druck- und Temperaturerhöhung die ur-sprünglichen Parameter wiederhergestellt wurden.

Aufgrund der in diesem Abschnitt gezeigten Messergebnisse konnte die Reversibilität der Temperatur- und Druckeffekte bezüglich der Methyl- und Methylengruppen der Serum- und Lipoprotein-Proben bestätigt werden. Im Allgemeinen treten nur Verän-derungen kleinerer Metaboliten auf. Hierbei ist die Substanz Ethanol meist nach Tem-peratur- und Druckerhöhung zu erwähnen. Wie bereits diskutiert, enthält das Wasser der Hochdruckleitung geringe Mengen von Ethanol. Somit kann Ethanol bei Anlegen eines hohen Drucks durch die Membran von den Leitungen in die Probe gelangen.

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