DNA-Klonierungsverfahren und -synthese

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren zur überexponentiellen Vervielfältigung definierter DNA-Fragmente in vitro (Saiki et al., 1988). Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung des TaqPlus™ Precision Systems

(Stratagene, Heidelberg) in einem programmierbaren Thermocycler (PERKIN ELMER GeneAmp™ 9600 oder Mastercycler gradient, Eppendorf).

Dank des thermostabilen Enzymgemisches aus Pfu-DNA-Polymerase und Taq-DNA- Polymerase und dessen 3´-5´-Exonuklease-Aktivität (proof-reading) kann eine fehlerfreie Amplifikation erreicht werden. Die aus dem thermophilen Eubacterium Thermus aquaticus isolierte DNA-abhängige Taq-Polymerase besitzt zwar hohe Prozessivität, jedoch keine Exonuklease-Aktivität. Die ebenfalls DNA-abhängige Pfu- Polymerase wiederum wird aus Pyrococcus furiosus gewonnen, hat allerdings aufgrund ihrer 3´- 5´-Exonuklease-Aktivität eine Prozessivität von 2 min/kb wodurch sich die Amplifikation auf DNA-Fragmente von 5-10 kb Größe beschränkt.

2.2.2.1.1. Oligonukleotide

Die im Anhang aufgeführten Oligonukleotide wurden als Startermoleküle (Primer) für PCR-Klonierung, PCR-Analyse (PCR-Screening), gerichtete Mutagenese oder für Sequenzierungen eingesetzt. Alle Oligonukleotide wurden in entsalztem, lyophilisierten Zustand von der Firma Invitrogen bezogen.

Für eine Standard-PCR wurden 50-100 ng Plasmid- DNA in einem 100 µl Ansatz (2,5 U TaqPlus™ Precision Polymerase, 0,25 mM dNTP-Mix, 5 pmol 3´-Oligonukleotide, 5 pmol 5´-Oligonukleotide, 1 x Reaktionspuffer) unter nachfolgenden Bedingungen amplifiziert:

2.2.2.1.2. Standard-PCR

Standard-PCR Ansatz (50µl) PCR- Reaktionsbedingungen

50 - 100 ng Plasmid-DNA als

Matrize Temperatur Dauer Zyklen

20 pmol 5’-Oligonukleotide Initiale

Denaturierung 95°C 3 min 1

20 pmol 3’-Oligonukleotide Denaturierung 95°C 30 sec 30

1,125 U TaqPlus™ Precision Polymerase

Annealing 50°C- 60°C 45- 55 sec 30

1 x PCR Reaktions-

Puffer

Elongation 72°C 2 – 3 min 30

0,125 µmol MgCl2 Finale Elongation 72°C 10 min 1

0,01 µmol (je Nukleotid)

dNTP- Mix (NEB)

Mit H2O steril auf 50µl auffüllen

Tab. 2.1: Reaktionsbedingungen und 50µl Ansatz einer Standard-PCR.

Als Richtlinie für die Hybridisierungstemperatur wurden 5°C unter dem Schmelzpunkt des Oligonukleotides gewählt, als Polymerisationszeit wurde 1 min pro kb eingeplant.

2.2.2.1.3. QuickChange Mutagenese

Als Matrize diente dam-methylierte Plasmid-DNA, die mittels Pfu-Polymerase amplifiziert wurde. Zwei komplementäre Oligonukleotide, welche beide in ihrer Sequenz den gewünschten Basenaustausch tragen, dienten als Primer.

Die PCR-vermittelte Mutagenese wurde nach Herstellerangaben in einem 50 µl Ansatz (25-50 ng Matrizen-DNA, 2,5 U Pfu-Polymerase, 0,25 mM dNTP-Mix, 125 ng sense-Primer, 125 ng antisense-Primer, 1 x Reaktionspuffer) unter Standard-Bedingungen durchgeführt.

Durch die anschließende Zugabe des Restriktionsenzyms DpnI zu dem Pfu-Amplifikationsansatz, das spezifisch das dam-Methylierungsmuster 5´-G^m6ATC-3´

erkennt, wird die methylierte Matrizen-DNA durch Verdau ausselektioniert. Die mutierte, zirkuläre, unmethylierte und unligierte dsDNA wird nach der Transformation von E. coli durch die bakterielle DNA-Ligase geschlossen.

2.2.2.1.4. Fusions-PCR

Mittels einer Fusions-PCR kann aus zwei DNA-Matrizensträngen ein Fusionsprodukt hergestellt werden. Hierzu wurden mit dem TaqPlusTM Precision System und der Pfu-DNA-Polymerase zunächst zwei PCR-Produkte mit einem Überhang aus ca. 15-25 Nukleotiden hergestellt, wobei die eingesetzten Primerpaare jeweils aus einem Primer mit Restriktionsschnittstellen und einem Primer mit Überhang bestanden. Der Überhang wurde dabei so gewählt, daß er komplementär zu dem zu fusionierenden Produkt war. In einem 50 µl Reaktionsansatz aus aufgereinigten PCR-Produkten, Oligonukleotiden, Reaktionspuffer, Pfu-Polymerase und dNTP-Mix wurden diese nun fusioniert, indem nach der Strangdenaturierung die komplementären Überhänge hybridisiert und die neu entstandenen Überhänge durch die DNA-Polymerase aufgefüllt wurden. Die Teilfragmente dienten hiernach als Matrize für die Amplifikation des Fusionsproduktes in einem gemeinsamen PCR- Ansatz mit den beiden äußeren Oligonukleotiden. Das neu gewonnene Fusionsprodukt stand dank der durch die Primer mitgelieferten, singulären Schnittstellen für weitere Klonierungsarbeiten zur Verfügung.

2.2.2.1.5. „Colony screening“

Zur Charakterisierung rekombinanter Bakterienklone wurde das PCR-screening eingesetzt. Für den PCR-Ansatz und das Amplifikationsprogramm wurden die gleichen Bedingungen gewählt wie bei der Plasmid-PCR mit der Taq-Polymerase.

Als Matrize dienten gepickte Klone aus der Plasmid-Transformation.

2.2.2.2. Enzymatische Spaltung

Zur Analyse der aus E. coli isolierten Plasmid-DNA, sowie für präparative Zwecke wurde die DNA mit Restriktionsendonukleasen (Roche, Mannheim oder New England BioLabs, Schwalbach Taunus) enzymatisch geschnitten. Eine Einheit [U]

bezeichnet dabei die Enzymaktivität, die benötigt wird, um 1µg DNA in einer Stunde bei optimalen Temperatur-, Puffer- und pH-Bedingungen vollständig zu schneiden.

2.2.2.2.1. Restriktionsenzyme

Für Klonierungen wurden Enzyme mit den benötigten Puffern von den Firmen Roche oder New England BioLabs (NEB) GmbH, Schwalbach/Taunus verwendet.

2.2.2.2.2. DNA-Molekulargewichtsstandards MGS-VII, MGS-VIII Roche

1kb- Standard NEB, Schwalbach/Taunus

2.2.2.2.3. Restriktionsverdau von Plasmid-DNA

Zur Charakterisierung gereinigter Plasmid-DNA wurde 1 µg DNA mit 10 U Restriktionsendonuklease und 1/10 Volumen Restriktionspuffer in einem 20 µl Ansatz für 1 Stunde bei entsprechender Temperatur geschnitten.

Für präparative Zwecke wurden in einem Standardansatz 5 µg bis 10 µg Plasmid- DNA mit je 60 U Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 50 µl ebenfalls mit 1/10 Volumen Restriktionspuffer für mindestens zwei Stunden bei entsprechender Temperatur inkubiert.

War ein Verdau mit mehreren Enzymen notwendig, wurden die Pufferbedingungen so gewählt, dass alle eingesetzten Enzyme mindestens 75-100% ihrer maximalen Aktivität aufwiesen. Bei nicht kompatiblen Bedingungen wurde zuerst mit dem ersten Enzym und entsprechendem Puffer verdaut, die DNA mittels Natriumacetat-Fällung aufgereinigt und anschließend mit dem zweiten Enzym, dem dazugehörigen

Puffersystem und entsprechendem Temperaturoptimum geschnitten. Enzymatische Spaltungen, welche dam- und dcm-sensitive Restriktionsnukleasen erforderten, wurden mit Plasmiden durchgeführt, die aus dem Stamm GM2163 präpariert worden waren.

2.2.2.3. DNA-Sequenzierung

Alle DNA-Sequenzierungen wurden von der Firma GeneArt (Regensburg) auf der Basis der Dideoxynukleotid-vermittelten Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) durchgeführt. Die Proben wurden sequenzierfertig aufbereitet (Gesamtvol. 8 µl; DNA 200-500 ng; 1 µl Primer) und nach Sequenzierung durch das Computerprogramm SeqMan (Version: Windows 32 SeqMan 3.57© 1989-1997 DNASTAR inc.) ausgewertet.

2.2.3. DNA-Fragmentisolierung aus Agarose-Gel