DNA-analytische Methoden

3.2.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR ermöglichte die in vitro Amplifikation definierter DNA-Fragmente und wurde in dieser Arbeit zur Einführung von Schnittstellen in DNA-Fragmente und zur Vervielfältigung von zu klonierenden DNA-DNA-Fragmenten eingesetzt. Die eingeführten Schnittstellen erlaubten nach einer Restriktion die gerichtete Klonierung der PCR-Produkte in ein Plasmid. Um eine spezifische Sequenz für einen weiteren Klonierungsschritt mit bestimmten Restriktionsschnittstellen zu amplifizieren, wurde ein Standard PCR-Protokoll durchgeführt In Abhängigkeit von den verwendeten Primern variierte die Annealingtemperatur zwischen 52 °C und maximal 60 °C.

Die Kettenreaktion lässt sich in drei Schritte unterteilen: Im ersten Schritt wird die zu amplifizierende dsDNA thermisch (94 bis 100 °C) denaturiert, so dass zwei Einzelstränge vorliegen. Im nächsten Schritt erfolgt bei einer geringeren Temperatur (45 bis 72 °C) die Hybridisierung („annealing“) der Primer an die ssDNA. Die Primer werden im dritten Schritt, der bei einer Temperatur von 72 °C abläuft, durch eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) verlängert. Diese drei Schritte werden zyklisch wiederholt, und durch eine 25- bis 35-fache Wiederholung dieses Zyklus lässt sich eine Amplifikation der DNA um den Faktor 10⁹ erreichen.

PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Die Ausgangsmenge an Template-DNA betrug 500 ng. Ein PCR-Ansatz enthielt neben der zu amplifizierenden DNA:

5 µl PCR-Puffer (10x) 250 µM jedes dNTP 5 pmol jedes Primers 2,5 mM MgCl2

1 U Taq-Polymerase ad 50 µl H2O

Für ein bis zu 1500 bp langes DNA-Fragment fand die Amplifikation in einem DNA-Thermo-Cycler nach folgendem Programm statt (x: je nach Primer zwischen 52 und 60 °C):

1. 5 Minuten 94 °C (einmalige Denaturierung) 2. 1 Minute 94 °C

1 Minute x °C 35 Zyklen 1,5 Minuten 72 °C

3. 10 Minuten 72 °C (abschließende Polymerisationsreaktion)

Im Anschluss an die PCR wurden die amplifizierten Produkte im Agarosegel analysiert.

3.2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese

Plasmide und DNA-Fragmente wurden auf 0,8-1,2 % Agarose-Gelen (0,1 mg/ml Ethidiumbromid) der Abmessung 80x90x7 mm bei 100 V aufgetrennt.

Als Elektrophoresepuffer wurde TAE-Puffer verwendet. Vor dem Auftrag der DNA-Proben auf das Gel wurden die Proben mit DNA-Probenpuffer versetzt.

Parallel zu den Proben wurde ein DNA-Größenstandard aufgetrennt. Die Detektion der DNA erfolgte unter UV-Licht (254 nm).

3.2.2.3 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente wurden unter UV-Licht aus dem Agarosegel als kleiner Block ausgeschnitten; ein Arbeitsschritt, der sehr rasch erfolgen musste, um Strangbrüche und Mutationen der DNA durch das UV-Licht zu verhindern. Die in der wäßrigen Phase des Gels enthaltene DNA wurde durch Zentrifugation über ein Glaswolle-Filter für 5 Minuten bei 14000 x g von der festen Agarosematrix getrennt. Zu dem Durchfluss wurde das 2,5-fache Volumen EtOH und ¹/10

Volumen KAc gegeben. Die DNA wurde für 1 Stunde auf Trockeneis oder bei -20 °C über Nacht gefällt und dann für ¹/2 Stunde bei 14000 x g (4° C) pelletiert. Abschließend wurde die DNA mit 70 % EtOH gewaschen und nach dem Trocknen in 50 µl ddH2O resuspendiert.

3.2.2.4 Spaltung von Plasmid-DNA durch Restriktions-Endonukleasen

Restriktionsendonukleasen sind in der Lage, doppelsträngige DNA an für sie spezifische, meist palindrome Erkennungssequenzen zu schneiden. Für eine vollständige Restriktion benötigen die Restriktionsenzyme spezielle Puffer, die optimale Ionenstärke und den adäquaten pH-Wert liefern. Die für eine Restriktion benötigte Menge Enzym richtet sich nach der zu schneidenden DNA-Menge. Zur groben Abschätzung kann man davon ausgehen, dass 1 U Restriktionsenzym ausreicht, um 1 µg DNA in einem 50 µl Ansatz innerhalb einer Stunde zu schneiden.

Sequenzielle Doppelrestriktionen wurden in zwei Schritten durchgeführt, jeder in Bezug auf die jeweilige Restriktionsendonuklease optimiert. Nach der ersten Restriktion wurde der Ansatz in einem Agarosegel aufgetrennt, die entsprechende DNA-Bande aus dem Gel eluiert und aufgereinigt.

Anschließend wurde die DNA mit der zweiten Restriktionsendonuklease geschnitten.

Die Restriktionen wurden für 2 bis 4 Stunden bei der für das Restriktionsenzym optimalen Reaktionstemperatur (meist 37 °C) inkubiert.

Daraufhin erfolgte eine Überprüfung der Restriktion im Agarosegel und eine anschließende Reinigung der geschnittenen DNA vor der weiteren Verwendung.

3.2.2.5 Dephosphorylierung der Plasmide vor einer Ligation

Um bei der Ligation die Wahrscheinlichkeit einer Religation der Plasmide zu verringern, wurden die Plasmide nach der Restriktion dephosphoryliert. Dazu wurden die Restriktionsansätze 30 Minuten bei 37°C mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (SAP) inkubiert. Dabei wurden für 5'-überhängende Enden 0,1 Unit bei 1 pmol Termini benötigt. Dies entspricht ca. 2,5 µg eines 3 kb großen Plasmids. Um SAP zu inaktivieren, wurde der Ansatz für 15 Minuten bei 65 °C inkubiert.

3.2.2.6 Ligation von DNA-Fragmenten

Ziel der Ligation ist es, glatte oder überhängende Enden von DNA-Fragmenten mit Hilfe der T4-DNA-Ligase kovalent über die endständige 5´-Phosphatgruppe mit der freien 3´-OH Gruppe zu verknüpfen.

Vektoren und zu inserierende DNA-Fragmente wurden im molaren Verhältnis von 1:3 mit einer Gesamtmenge an DNA von maximal 200 ng eingesetzt. Die DNA wurde in 17 µl ddH2O aufgenommen und mit 2 µl 10x T4-DNA-Ligationspuffer versetzt. Der Reaktionsansatz wurde vermischt und nach Zugabe von 1 µl T4-DNA-Ligase 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Die ligierte DNA wurde ohne weitere Aufarbeitung in den Transformationen verwendet.

3.2.2.7 Konzentrationsbestimmung von DNA

Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde spektralphotometrisch bei 260 nm bestimmt (1 OD260 = 50 µg DNA/ml). Der Quotient OD260/OD280 diente dabei als Maß für die Reinheit der DNA und betrug im Idealfall 1,8.

3.2.2.8 Abschätzung von DNA-Mengen im Agarosegel

DNA-Mengen wurden im Agarosegel über einen Vergleich der Fluoreszenzintensität der zu untersuchenden DNA-Bande mit der Fluoreszenzintensität von Banden eines quantifizierten DNA-Größenstandards abgeschätzt. Mit Hilfe eines solchen DNA-Standards konnten DNA-Mengen bis zu 15 ng im Agarosegel quantifiziert werden.