0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 0
5 10 15 20
gesamtes Signal (counts)
Häufigkeit
Abbildung 3.39: Histogramm der GFP-Signalstärken der Bakterien.
3.4. DISKUSSION 113 Dieser Effekt wurde hier nicht beobachtet. Der Grund hierfür ist, daß die ein-zelnen Teilstrahlen im Strahlteiler leicht unterschiedliche Wege zurücklegen, so daß sie die Probe zu verschiedenen Zeiten durchlaufen. Da sich die Zeiten um mehr als die Pulsdauer unterscheiden, können sich die Foki nicht beeinflussen und die Tie-fenauflösung ist unabhängig vom Strahlabstand.
3.4.3 Die Signalstärke
In diesem Abschnitt soll die beobachtete Signalstärke mit den Erwartungen nach den Abschätzungen in Abschnitt 3.1.2.1 verglichen werden. Als Detektor wurde die CCD-Kamera allein sowie die Kamera mit Bildverstärker benutzt. Als Probe wurde Coumarin 500 in Glycol gelöst verwendet; die Konzentration betrug 1:5mg=ml bzw.105M.
3.4.3.1 Detektion mit der CCD-Kamera
Bei der Messung ohne Bildverstärker wurde bei einer Laserleistung von2mW und einer Belichtungszeit von60s ein Signal von6000counts (42000 Elektronen) re-gistriert. Berechnet man mit Hilfe der Gleichungen (3.9) und (3.10), welche Zeit zur Aufnahme dieses Signal benötigt werden sollte, kommt man auf t = 31s.
Dabei wurde für die Quanteneffizienz der CCD-Kameraq = 0:3und für die Sam-meleffizienz = 0:3 angenommen. Trotz der Unsicherheit, die durch die ge-schätzten Werte für die Quanteneffizienz des Farbstoffs und den Zweiphotonen-Absorptionsquerschnitt entsteht, liefert die Abschätzung also realistische Werte für die Signalstärke.
3.4.3.2 Detektion mit dem Bildverstärker
Bei einer entsprechenden Messung mit dem Bildverstärker wurden bei einer MCP-Spannung von540V und200ps Öffnungsdauer in10ms Belichtungszeit9000counts gemessen; das entspricht bei 0:5counts=Photoelektron (siehe Abb. 3.21) 18000 Photoelektronen (1:8106 Photoelektronen=s). Aus der Messung mit der Kamera kann der Photonenfluß, der den Detektor erreicht, berechnet werden:
0
= 42000=(0:360s) = 2109 s 1. Daraus ergibt sich eine Nachweiswahr-scheinlichkeit des Bildverstärkers vonq=910 4.
Die Nachweiswahrscheinlichkeitqsetzt sich aus zwei Faktoren zusammen: der Quanteneffizienz der Photokathodeqpcund einem Faktorcdc, der die Öffnungsdauer
tdes Bildverstärkers berücksichtigt.
Der zweite Faktor kann so berechnet werden:
c
dc
= R
g(t t
0
)(t)dt
R
1=f
0
(t)dt
(3.32) Dabei stehtg für die Öffnungscharakteristik des Bildverstärkers undt0 für den Be-ginn der Detektion relativ zum Laserpuls. 1=f ist der zeitliche Abstand der La-serpulse. Nimmt man an, daß die Fluoreszenz einfach-exponentiell abklingt, im
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Fluoreszenzlebensdauer τ (ns) cdc
Abbildung 3.40: Die Abhängigkeit des Faktorscdcvon der Fluoreszenzlebensdauer
. Die Kurve wurde fürf =76MHz undt=200ps berechnet.
Maximum detektiert wird und die Öffnungscharakteristikg eine Rechteckfunktion der Breitetist, ergibt sich daraus
c
dc
= R
t
0
exp ( t=)dt
R
1=f
0
exp ( t=)dt
=
1 exp ( t=)
1 exp ( 1=f)
: (3.33)
Die Abhängigkeit voncdcvon der Fluoreszenzlebensdauerist fürf =76MHz und
t =200ps in Abbildung 3.40 dargestellt. Für große Werte von nähert sichcdc
dem Grenzwertftan (hier0:015). Für =4:8ns (Coumarin in Glycol) ergibt sichcdc
=0:044; damit ist die Quanteneffizienz der Photokathodeqpc
=0:020. Dieser Wert ist fünfmal niedriger als erwartet — für kontinuierlichen Betrieb wird vom Hersteller ein Wert von 0:1 angegeben. Der Grund für die niedrigere Ausbeute liegt in der Ansteuerung des Bildverstärkers: Bei den kurzen Öffnungs-dauern wird an der Photokathode nicht die Spannung erreicht, die für einen opti-malen Betrieb nötig ist. Die Spannung zwischen Photokathode und MCP hat dann im geöffneten Zustand nicht einen Wert von 120V sondern nur von 20V [103], d. h. die Photoelektronen werden nicht so stark auf die MCP beschleunigt. Dies führt dazu, daß die Wahrscheinlichkeit, Sekundärelektronen auszulösen, sinkt und die Photoelektronen effektiv nicht zum Signal beitragen.
Die Nachweiswahrscheinlichkeit der CCD-Kamera ist etwa dreihundertfach größer als die des Bildverstärkers (so wie er in diesem speziellen Fall betrieben wurde). Dazu tragen mehrere Faktoren bei, die im folgenden aufgelistet werden:
1. Die kurze Öffnungsdauer des Bildverstärkers (cdc): Dieser Faktor ist unver-meidlich und ist der Preis, den man für die Messung der
Fluoreszenzlebens-3.4. DISKUSSION 115 dauer zahlen muß. Man kann cdc durch Anpassen der Öffnungszeit an die Lebensdauer, die gemessen werden soll, steigern. Dabei muß man einen Kompromiß zwischen Reduktion der Zeitauflösung und Erhöhung der Nach-weiseffizienz eingehen. Arbeitet man z. B. mit einer Öffnungsdauer, die halb so groß ist, wie die Lebensdauer, erhält man einen Wert voncdc
0:4. 2. Die geringere Quanteneffizienz der Photokathode: Die cw-Quanteneffizienz
der Photokathode ist um einen Faktor 3 geringer als die Quanteneffizienz der CCD-Kamera.
3. Die Erniedriegung der effektiven Quanteneffizienz durch die Ansteuerung des Bildverstärkers: Dies reduziert die Nachweiswahrscheinlichkeit um einen Faktor5. Dieser Effekt könnte durch eine bessere Bildverstärkerelektronik soweit verringert werden, daß die Quanteneffizienz den cw-Wert erreicht.
Selbst bei optimalen Bedingungen (Anpassung von cdc, verbesserte Ansteuerung des Bildverstärkers) ist die Nachweiswahrscheinlichkeit mit Bildverstärker etwa achtmal geringer als ohne; d. h. die Kamera ist dem Bildverstärker vorzuziehen, wenn auf die Messung der Fluoreszenzlebensdauer verzichtet werden kann.
Die Nachweiswahrscheinlichkeit ist ein wesentlicher Faktor für das erreichbare Signal/Rausch-Verhältnis. Allgemein haben CCD-Kameras (bzw. Halbleiterdetek-toren) eine höhere Quanteneffizienz als Photokathoden — auch im Vergleich mit Photomultipliern sind die Kameras daher in diesem Punkt überlegen. Das Problem der CCD-Kameras ist das hohe Ausleserauschen, das den Nachweis kleiner Signale verhindert (siehe Gl. (3.24)).
3.4.4 Die Scangeschwindigkeit
Die maximale Scangeschwindigkeit wird durch die Zeit, die zur Integration des Signals nötig ist, bestimmt. Bei Verwendung des Bildverstärkers sind 1 ms, bei Verwendung der Kamera 100s Belichtungszeit pro Scanposition nötig. In dem hier verwendeten Aufbau ist die Auslesegeschwindigkeit der CCD-Kamera der zweite begrenzende Faktor, da für jede Scanposition ein Bild aufgenommen wird. Bei gleichzeitiger Aufnahme von 64 Signalen und einer Bildrate von200fps (fps = frames per second) ist die Pixelrate 1:3104 s 1. Dieser Wert entspricht dem, was bei einem herkömmlichen Mikroskop mit einem Strahl ohne Messung der Fluoreszenzlebensdauer erreicht wird.
Die Pixelrate kann durch mehr Teilstrahlen und eine schnellere Kamera gestei-gert werden. Kommerzielle fs-Laser14liefern eine Leistung von1W bei einer Puls-dauer von30fs, d. h. mit einem solchen Laser lassen sich einige hundert Teilstrahlen erzeugen. Hochgeschwindigkeitskameras sind in der Lage, bis zu5000fps zu lie-fern.15 Mit einem optimierten Aufbau sollte daher eine Pixelrate von ca.5105s 1
14Die Daten beziehen sich auf einen Coherent Vitesse.
15PixelVision: Fast One
(mit BV) bzw.2106s 1erreicht werden; dies ist etwa hundertmal schneller als bei herkömmlichen Zweiphotonenmikroskopen.
Das Problem der Auslesegeschwindigkeit der Kamera entfällt ganz, wenn die Strahlen gescannt werden und die Fluoreszenzsignale auf der Kamera integriert werden (sog.non de-scanned detection). Der Nachteil dieser Methode besteht dar-in, daß die Auflösung reduziert wird, wenn das Fluoreszenzlicht beim Austreten aus der Probe gestreut wird. Dieses Verfahren ist im allgemeinen nur bei dünnen Objekten geeignet.