Vorhandensein, die Lokalisation der Rezeptoren und ihrer Expressionsstärke (Bergqvist et al., 1991; Di Lieto et al., 1997; Melega et al., 1991; Prentice et al., 1992;
Zhang et al., 1993). Bezug nehmend auf die kontroverse Datenlage ist allgemein zu berücksichtigen, dass bei den Untersuchungen verschiedene Methoden und Antikörper gegen EGFR eingesetzt wurden, die heute optimiert sind und somit besser interpretierbare Ergebnisse liefern. Zudem wurde in unserer Untersuchung eine größere Grundgesamtheit betrachtet, was die Ergebnisse besser beurteilbar macht. Der EGFR wurde bislang nur in peritonealen Endometrioseherden untersucht.
Die Expression dieses Rezeptors wurde zum einen von Bergqvist als diffus-zytoplasmatisch beschrieben (Bergqvist et al., 1991), von Prentice et al. hingegen als membranständig charakterisiert (Prentice et al., 1992), wobei dort nur die Hälfte der 27 untersuchten Läsionen einen positiven Nachweis für EGFR zeigten. In unsere Untersuchungen konnte EGFR in allen drei Endometrioseformen detektiert werden.
Dabei wurde hauptsächlich eine zytoplasmatische Lokalisation, wie bei Bergqvist beschrieben, beobachtet, aber auch einige membranständige Expressionsmuster festgestellt, was die Beobachtung von Prentice unterstützt (Abb. 5). Obwohl die EGF Rezeptoren hauptsächlich membranständig lokalisiert sind, ist auch für andere Gewebe eine diffus-zytoplasmatische Expression beschrieben worden (Hughes et al., 2004; Sorkin, 2001; Srinivasan et al., 2000; Wiley, 2003). Man geht davon aus, dass die Lokalisation der Rezeptoren abhängig ist von dem Aktivitätsgrad und der Phosphorylierung (Hughes et al., 2004). Die EGF Rezeptoren unterliegen einem ständigen Erneuerungsprozess, indem sie nach Ligandenbindung internalisiert und recycled werden. Der EGFR wird allerdings in Endosomen langsamer abgebaut und nicht recycelt (Wiley, 2003), so dass er noch eher als die anderen drei EGF Rezeptoren im Zytoplasma detektierbar ist. Da bei unseren Untersuchungen alle vier Rezeptoren fast ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert waren (Abb. 5, 6, 7), scheint es, dass die EGF Rezeptoren in Endometriosezellen hauptsächlich nach ihrer Aktivierung und folgender Internalisierung detektiert wurden. HER-4 bildete mit seiner nuklearen Lokalisation eine Ausnahme, auf die später noch eingegangen wird (Abb. 5, 6, 7). Bestätigend zu den immunhistochemischen Untersuchungen, wurde in der primären Zellkultur bei Einzelzellen zunächst ebenfalls eine diffus-zytoplasmatische der EGF Rezeptoren beobachtet (Abb. 10, 11). Interessanterweise konnte im Zellverband unter Ausbildung von sog. stress fibers ein starke membranständige EGFR-Expression beobachten werden, wobei der EGFR an den
Zell-Zell-Verbindungsstellen kumulierte (Abb.12). Gleiches wurde auch für die HER-2 Expression beobachtet. Dieses Phänomen wird als Translokation bezeichnet und ist für den EGFR beschrieben worden (Gladhaug et al., 1988), wobei der Auslöser der Translokation weitgehend unbekannt ist (Pike et al., 2002; Roepstorff et al., 2002).
Da die EGF Rezeptoren im membranständigen Zustand durch Ligandenbindung aktiviert werden, gehen wir davon aus, dass die Translokation von einem uns unbekannten Stimulus induziert wird und somit die EGF Rezeptoren für ihre Aktivierung bereitgestellt werden.
Der EGFR wird in peritonealen Endometrioseläsionen sowohl im Epithel als auch Stroma exprimiert (Huang et al., 1994; Prentice et al., 1992). Huang et al. zeigten, dass die epithelialen Zellen eine stärkere Expression von EGFR aufwiesen als die stromalen Zellen (Huang et al., 1994) wohingegen Zhang et al. keinen Unterschied in der Expression zwischen den beiden Kompartimenten beschrieben (Zhang et al., 1993). Keine stromale Expression und nur eine schwache epitheliale Färbung wurde von Scotti et al. beobachtet (Scotti et al., 2000). Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen stehen unsere Untersuchungen, die zeigen, dass EGFR von allen vier EGF Rezeptoren der am stärksten exprimierte Rezeptor in den stromalen Zellen ist (Tab.6, 7, 8). Zudem wird er auch im Epithel der drei Läsionstypen exprimiert wird (Tab.6, 7, 8). Diese abweichenden Ergebnisse können durch verschieden angewandte Methoden oder verschiedene Antikörper auftreten. Unsere immunhistochemischen Untersuchungen konnten wir mit einem zweiten, anderen Primärantikörper gegen EGFR bestätigen. Interessanterweise war der EGFR in den Stromazellen, die direkt an den epithelialen Zellen lokalisiert sind, am stärksten exprimiert, so dass sich ein stark angefärbter ein Ring um die Drüse bildete (Abb.5, 6, 7). Diese Zellen unterschieden sich auch morphologisch von den anderen Zellen, da sie kleiner und enger gepackt waren. Zudem war zu beobachten, dass die Expression von EGFR schwächer und diffuser wurde je weiter die stromalen Zellen von der Drüse entfernt lagen. Eine ähnliche Beobachtung machten Coleman et al.
schon 1988 an der Brustdrüse einer Maus und schlossen daraus, dass das Epithel die Expression von EGFR im Stroma induziert (Coleman et al., 1988).
Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Stromazellen sind wurden schon von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben (Cunha et al., 2004; Roberts et al., 1988). Zum einen können unsere Untersuchungen darauf hinweisen, dass diese direkt an der Drüe anliegenden Stromazellen eine spezielle parakrine Funktion
besitzen, die das Zellwachstum sowie das Überleben der Zellen beeinflussen. Zum anderen können diese Zellen, die sich morphologisch eindeutig von den anderen Zellen absetzen, einer phänotypischen Änderung unterliegen. Diese Art der Änderung wird als epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) bezeichnet und ist ebenfalls von mehreren Autoren beschrieben worden (Boyer et al., 2000; Guarino et al., 1999; Rosivatz et al., 2002). Die EMT ist ein natürliches Phänomen in der Entwicklung von Organen und der Wundheilung, bei dem sich epitheliale Zellen in mesenchymale umwandeln, indem ihr Zytoskelett neu geordnet wird (Guarino et al., 1999). Dieser Prozess beinhaltet u.a. den Verlust der adhäsiven Zellkontakte, Ausbildung einer fibroblastenartigen Zellform und eine erhöhte Zellmotilität (Hay, 2005). Da die EMT auch mit einem Verlust über die Wachstumskontrolle einhergehen kann, wird sie mit der malignen Transformation von Zellen in der Tumorgenese in Verbindung gebracht (Hay, 2005). Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass eine EMT auch durch Wachstumsfaktoren aus der Familie der Tyrosinkinase Rezeptor-bindenden Faktoren, wie z.B. EGF oder Heregulin, induziert werden kann und somit eine verstärktes Wachstum über die EGF Rezeptor Signaltransduktionswege ausgelöst wird (Boyer et al., 2000; Kiemer et al., 2001).
Das Vorkommen von EGF und anderen spezifischen Liganden der EGF Rezeptoren in endometriotischen Läsionen ist beschrieben worden (Scotti et al., 2000; Simms et al., 1991). Demir et al. konnten zeigen, dass Menstrualblut, welches durch retrograde Menstruation in den Bauchraum gelangt, eine EMT unter Einbeziehung von Tyrosinkinase assoziierten Signaltransduktionswegen auslösen kann (Demir et al., 2004). Auch Mai et al. gingen von einer Neuentstehung von Stromazellen in Endometrioseläsionen aus, die ebenfalls durch eine Transformation ausgelöst wurde.
Zusätzlich wurde diskutiert, dass die schon bestehende Läsion als Produzent für EMT induzierende Faktoren, wie Wachstumsfaktoren oder Hormone, dienen kann und somit den Umwandlungsprozess und im weiteren Sinne ein gesteigertes Wachstum fördert (Mai et al., 1997). Nimmt man diese Fakten und Thesen zusammen, so kann man annehmen, sich die Zellen, die den von uns beobachteten Stromaring bilden, in der Phase einer epithelialen-mesenchymalen Transition befinden, die durch EGFR spezifische Wachstumsfaktoren induziert ist. Dies wäre ein Erklärungsansatz für das Wachstum der Endometrioseläsionen und ihre Metastasierung. Zudem zeigen unsere Untersuchungen, dass sich der Stromaring unter verschiedenen endokrinen Behandlungen verändert. Der Ring ist unter
GnRH-a-Therapie klarer und stärker ausgeprägt als unter OC-Gabe oder ohne endokrine Therapie (Abb.8). Daher scheint es, dass trotz Östrogenentzug die Endometriosezellen sich verbreiten und so einen endokrin resistenteren Phänotyp ausbilden können. Hier bedarf es zur vollständigen Klärung aber noch weiterer Untersuchungen.
Ein bestehender Zusammenhang zwischen dem EGFR und Östrogenrezeptor ist mittlerweile bewiesen. Auch in Endometrioseläsionen wurde ein möglicher Einfluss eines Östrogenentzuges auf die EGFR Expression schon untersucht. Di Lieto et al.
und Melega et al. verglichen die Expression von EGFR in Endometrium und Endometrioseläsionen von 36 bzw. 41 Endometriosepatientinnen vor und nach der Therapie mit einem GnRH-Analogum (Goserelin) bzw. Danazol. Di Lieto stellte fest, dass die Behandlung mit dem GnRH-Analogum zu einer starken Abnahme der EGFR Expression sowohl im Endometrium als auch in den Endometrioseläsionen führte (Di Lieto et al., 1997). Melega beobachtete ein ähnliches Ergebnis nach der Behandlung mit Danazol. Dabei konnte er ebenfalls nachweisen, dass 20% der Patientinnen nach 6-monatiger Therapie keine Östrogenrezeptoren mehr exprimierten – wogegen die EGFR Expression zwar abgenommen hatte, aber noch nachweisbar war (Melega et al., 1991). Unsere Untersuchungen zeigten keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen der Therapie und der Expression von EGFR in den Endometrioseläsionen. Auch für HER-2 bis -4 ließ sich kein Zusammenhang mit der Therapie darstellen, die Expression des Östrogenrezeptors war auch nach Therapie mit GnRH-Analoga im Gegensatz zu den Untersuchungen von Melega unverändert. Ein Expressionsvergleich der EGF Rezeptoren und dem korrespondierenden Endometrium wurde in dieser Arbeit nicht untersucht, da der Fokus auf der endokrinen Regulation der EGF Rezeptoren in Endometrioseläsionen lag, auf die im weiteren Verlauf ausführlich eingegangen wird. Die Untersuchungen zur Expression von HER-2 in peritonealen Läsionen und ovariellen Endometriosezysten zeigten grundsätzlich nur eine schwache bis keine Expression von HER-2 (Bergqvist et al., 1991; Nasu et al., 1995; Schneider et al., 1998) wobei beschrieben wurde, dass der Rezeptor stärker in den epithelialen Zellen als in den stromalen exprimiert wurde (Bergqvist et al., 1991). Unsere Ergebnisse bestätigen die Angaben, dass HER-2 hauptsächlich in den epithelialen Zellen exprimiert ist, wobei rectovaginalen Zellen die stärkste Expression zeigen (Diagramm 13, 14).
HER-2 wird in den peritonealen, ovariellen und rectovaginalen Läsionen meist
schwach (48%; 25%; 58%) bis moderat exprimiert (35%; 42%; 13%), wobei die Expressionsmuster der EGF Rezeptoren in rectovaginalen Endometrioseläsionen vorher noch nicht untersucht wurden. Die stromalen Zellen der ovariellen und rectovaginalen Endometrioseläsionen zeigen eine schwache (17%; 10%) bis keine (75%; 90%) Expression von HER-2. In den Stromazellen der peritonealen Läsionen war keine HER-2 Expression detektierbar.
Die vorhandenen Unterschiede in den Expressionsmustern der EGF Rezeptoren können verschiedene Ursprünge haben, die im weiteren Verlauf noch ausführlich diskutiert werden. HER-2 gilt als der bevorzugte Dimerisierungspartner für die anderen EGF Rezeptoren, obwohl er keinen bekannten Liganden besitzt (Hudelist et al., 2003). Trotzdem erhöht sich durch HER-2 in einem Heterodimer die Ligandenbindungsaffinität, was ein verlängertes und verstärktes Signal zu Folge hat (Citri et al., 2003). Der bevorzugte Dimerisierungspartner von HER-2 ist erstaunlicherweise HER-3, der keine Tyrosinkinaseaktivität besitzt. Dieses Heterodimer ist besonders stabil und zeichnet sich durch eine hohe Ligandenbindung und potente Aktivierung der Signaltransduktionswege aus (Citri et al., 2003). In dieser Arbeit wurden erstmals die Expressionsmuster aller vier EGF Rezeptoren in verschiedenen Endometrioseläsionen untersucht. Molekularbiologische Untersuchungen zu den Bindungsverhältnissen der einzelnen Rezeptoren miteinander sind nicht unternommen worden. Aber die Tatsache, dass 2, HER-3 und HER-4 in den epithelialen Zellen zu über 70% koexprimiert sind, legt nahe, dass sich auch in endometriotischen Zellen potente Heterodimere ausbilden können, die die Proliferation und Migration der endometriotischen Zellen beeinflussen. Eine Koexpression von EGFR und HER-2 wird mit der Ausbildung eines aggressiveren Phänotyps assoziiert, der sich negativ auf die Prognose des jeweiligen Tumors auswirkt (Normanno, Bianco et al., 2003). Auch für Endometriose kann gelegentlich ein aggressiverer Phänotyp unter, bzw. nach endokriner Therapie beobachtet werden (Ebert, 2003), so dass auch hier ein Zusammenhang mit der Expression von EGFR und HER-2 denkbar ist. Neben HER-2 Heterodimere können sich sowohl im Epithel als auch im Stroma EGFR oder HER-4 Homodimere, bzw. EGFR Heterodimere mit HER-3 und HER-4 ausbilden. Die Zusammensetzung der Dimere hat Einfluss auf die weitere Singnaltransduktionskaskade und somit verschiedene Effekte auf die Zielzelle (Olayioye et al., 2000). Es ist also davon auszugehen, dass die EGF Rezeptoren verschiedene Funktionen im Stroma und im Epithel erfüllen.
Für HER-4 wurde neben seiner zytosolischen auch eine nukleare Lokalisation sowohl in den Epithel- als auch in den Stromazellen beobachtet (Abb. 5, 6, 7). Eine nukleare Detektion ist für den EGFR sowie für HER-3 und -4 für verschiedene Gewebe beschrieben worden, u.a. für endometriale Stromazellen oder beim invasiven Mammakarzinom (Gullick et al., 1998; Offterdinger et al., 2002; Srinivasan et al., 2000; Wells et al., 2002). Normalerweise nehmen die EGF Rezeptoren auf die Aktivierung von Zielstrukturen im Nukleus indirekt über Aktivierung von Signaltransduktionskaskaden Einfluss (Carpenter, 2000). HER-4 ist aber in der Lage, die Genexpression im Nukleus direkter zu beeinflussen, zum einen durch eine eigene transkriptionale Aktivität und zum anderen als transkriptionaler Kofaktor (Heldin et al., 2001; Komuro et al., 2003; Williams et al., 2004). Durch Proteolyseprozesse in der membranösen Domäne des Rezeptors wird HER-4 in zwei Teile zerlegt, wovon der intrazelluläre Teil, der die aktive Tyrosine Kinasedomäne besitzt, in den Nukleus wandert. Dieses 80 kDa schwere Fragment von HER-4 konnte mittels Westernblot Analyse in den Primärzellen von uns nachgewiesen werden (Abb.18). Der proteolytische Vorgang wird als RIP für regulated intramembrane proteolysis bezeichnet, wobei der intrazelluläre Teil des Rezeptors im Falle von HER-4 durch eine γ-Secretase abgetrennt wird (Heldin et al., 2001). Ni et al. konnten zeigen, dass durch die Blockade der γ-Secretase das Wachstum von Fibroblasten, die eine HER-4-Überexpression aufwiesen, gehemmt wurde (Ni et al., 2001). Somit scheint die intrazelluläre Domäne von HER-4 eine Rolle bei der Expression von Genen zu spielen, die das Wachstum der Zelle kontrollieren. Auch für den EGFR gezeigt, dass Teile des aktivierten Rezeptors eine starke transkriptionale Aktivität aufwiesen und ebenso wie HER-4 das Wachstum der Zelle direkt beeinflussen können (Lin et al., 2001). Eine nukleare Lokalisation von EGFR konnte in den in dieser Arbeit untersuchten Endometrioseläsionen nur zu 1%
gefunden werden und ist somit vernachlässigbar. Interessanterweise wurde für das nukleare HER-4-Fragment ein transkriptionaler Einfluss auf das estrogen response element (ERE), welches östrogene Wirkungen vermittelt, in Mammakarzinomzellen beobachtet (Zhu et al., 2006). Zudem war das Auftreten der nuklearen HER-4 Form mit dem Vorkommen des ER signifikant assoziiert (Junttila et al., 2005). Somit scheint eine weitere Interaktion zwischen dem EGF Rezeptor System und dem ER System zu bestehen, welche auch in Endometriosezellen zum Tragen kommen
könnten und somit das Wachstum der Zellen auf eine weitere Weise beeinflussen könnte.
Betrachtet man die Expressionsmuster der EGF Rezeptoren im Überblick, so fällt auf, dass sich die Muster im Epithel und Stroma für den EGFR, HER-3 und HER-4 gegenläufig verhalten. EGFR ist in allen drei Lokalisationen im Stroma hauptsächlich moderat exprimiert, im Epithel hingegen schwach bis gar nicht (Diagramm.11,12).
Für HER-3 und HER-4 verhält es sich entgegengesetzt. Ist die epitheliale Expression der beiden Rezeptoren hoch, so ist die stromale eher gering (Diagramm 15, 16, 17, 18). Es scheint eine wechselseitige Beeinflussung auf die Expressionsstärke der EGF Rezeptoren in den endometriotischen Epithel- und Stromazellen vorzuliegen.
Eine Ausnahme bildet die Expression von HER-2, die Stroma hauptsächlich gering bis gar nicht vorhanden ist. Wechselwirkungen zwischen epithelialen und stromalen Zellen sind bekannt, jedoch ist der Mechanismus, bei dem Wachstumsfaktoren eine wichtige Rolle zu spielen scheinen, bis heute ungeklärt (Cunha et al., 2004; Roberts et al., 1988). Unsere Ergebnisse sowie die Ausbildung des Stromarings von EGFR liegen nahe, dass in Endometrioseläsionen starke Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Stromazellen vorliegen. Aber nicht nur die Epithelzellen können Einfluss auf die Stromazellen nehmen. Unlängst wurde von verschiedenen Autoren diskutiert, dass Stromazellen eine entscheidende Rolle von in der Tumorgenese besitzen (Bhowmick et al., 2005; Kim et al., 2005). Das Stroma kann, ebenso wie das Epithel, Wachstumsfaktoren, Metalloproteinasen und extrazelluläre Matrixproteine, von denen einige auch in Endometrioseläsionen nachgewiesen wurden wie z.B. EGF, exprimieren (Kim et al., 2005; Koninckx, Kennedy et al., 1999). Die dadurch hervorgerufenen Änderungen in der Mikroumwelt können Mutationen in Epithelzellen hervorrufen, die wiederum zu Transformationen führen können (Bhowmick et al., 2005). So ist anzunehmen, dass ein interzellulärer cross talk das Wachstum, die Progression und auch Differenzierungsprozesse der Endometrioseläsionen beeinflusst. Vergleicht man die einzelnen Rezeptorexpressionen in den drei untersuchten Läsionstypen, findet man statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsmustern der EGF Rezeptoren abhängig von der Lokalisation der Läsionen (Kap. 3.1.2). Interessanterweise zeigt sich für epitheliale Zellen, dass die signifikanten Expressionsunterschiede immer im Bezug auf die rectovaginalen Läsionen auftreten. So ähnelt sich das Expressionsmuster von EGFR im Epithel in den peritonealen und ovariellen Herden, unterscheidet sich aber von dem der
rectovaginalen Läsionen (p=0,001, bzw. p=0,37), da EGFR in den rectovaginal stärker exprimiert ist (Abb.11). Dieses Phänomen ist auch bei der epithelialen Expression von HER-3 (p=0,004 (perit-rv); p=0,032 (ov-rv)) und HER-4 (p=0,001 (perit-rv)) zu beobachten. HER-3 und HER-4 sind wesentlich stärker in den Epithelzellen der rectovaginalen Läsionen exprimiert (Diagramm 15, 16, 17, 18).
Betrachtet man die stromale Expression der EGF Rezeptoren, so treten hier signifikante Unterschiede zwischen der peritonealen Expression von HER-3 und HER-4 und den beiden anderen Läsionstypen auf (alle p=0.001), da diese beiden EGF Rezeptoren fast keine stromale Expression in den peritonealen Läsionen aufweisen. Ein signifikanter Expressionsunterschied von HER-2 ist zwischen dem stromalen, ovariellen Expressionsmuster und dem der anderen beiden Läsionsarten vorhanden (p=0,001) (ov-perit); p=0,009 (ov-rv)). HER-2 ist im Stroma der peritonealen Herde gar nicht und in den rectovaginalen zu 90% nicht exprimiert. In den ovariellen Läsionen ist HER-2 in den stromalen Zellen im Vergleich stärker exprimiert, aber im Allgemeinen auch nur schwach (keine 75%, schwach 17%, moderat 8%). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expressionsmuster der EGF Rezeptoren sich grundsätzlich ähneln, es aber doch signifikante Unterschiede in den Expressionen in den jeweiligen Lokalisationen gibt. Untersuchungen zu anderen Proteinexpressionen, wie z.B. von Matrixmetalloproteinasen, Kollagen IV oder der Aromatase, zeigen ebenfalls lokalisationsabhängige Expressionsunterschiede (Dufournet et al., 2006; Heilier et al., 2006; Nezhat et al., 2002). Da die Pathogenese der Endometriose bislang ungeklärt ist, gibt es kontroverse Meinungen über die Entstehung der verschiedenen Erscheinungsformen der Endometriose. Es wurde diskutiert, dass peritoneale, ovarielle und rectovaginale Endometrioseläsionen als drei eigenständige Erkrankungen mit unterschiedlichen Pathogenesen definiert werden sollten (Brosens et al., 2000; Donnez et al., 1996; Nisolle et al., 1997). Dabei sollte die peritoneale Endometriose sich retrograde Menstruation und folgende Implantation von Endometriumfragmenten an das Peritoneum manifestieren, wohingegen die ovarielle Endometriose aus metaplastischen Vorgängen entsteht. Da die rectovaginale Form der Endometriose einen ähnlichen Aufbau ist wie Adenomyoma zeigen, wird die Entstehung dieser Form durch Überbleibsel der Müllergänge postuliert (Nisolle et al., 1997). So könnten unsere Ergebnisse von lokalisationsabhängigen Expressionsmustern der EGF Rezeptoren durchaus die These unterstützen, dass peritoneale, ovarielle und rectovaginale
Endometrioseläsionen drei Entitäten verschiedenen Ursprungs sind. Andererseits können die unterschiedlichen Expressionsmuster auch ein Resultat der verschiedenen Mikroumwelten sein, die die Manifestation und Entwicklung der endometriotischen Läsionen beeinflussen. Die Peritonealflüssigkeit von Endometriosepatientinnen unterscheidet sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung zu der von gesunden Frauen (Giudice et al., 2004). Es ist z.B. die Zahl der aktivierten Makrophagen erhöht und dadurch auch die Konzentrationen diverser Zytokine, wie TNF alpha, verschiedener Interleukine, Wachstumsfaktoren oder angiogenetischer Faktoren (Siristatidis et al., 2006; Ulukus et al., 2005). Auf das proinflammatorische Milieu und die immunologische Komponente der Endometriose soll an dieser Stelle nicht weiter eingegangen werden. Wichtig ist allerdings, dass die peritonealen Endometrioseläsionen eher von der Peritonealflüssigkeit beeinflusst werden, wohingegen ovarielle Läsionen einer Mikroumwelt mit viel höheren Steroidhormonkonzentration ausgesetzt sind (Koninckx, Kennedy et al., 1999). Dies könnte eine Erklärung für die signifikant höhere HER-2 Expression im Stroma der ovariellen Herde sein, da eine endokrine Regulation des HER-2 schon für andere Gewebe beschrieben wurde (Yarden, 2001). Auch die rectovaginalen Endometrioseläsionen unterliegen dem Einfluss der Mikroumwelt, die allerdings an dieser Lokalisation anders zusammengesetzt sein kann. Zeigt die rectovaginale Endometriose ein invasives Wachstum, so können auch immunologische Faktoren aus dem Blut Einfluss auf die Expression von Zytokinen und Proteinen in den Läsionen nehmen (Koninckx, Kennedy et al., 1999). Diese Annahmen bieten eine mögliche Begründung für die unterschiedliche epitheliale wie auch stromale Expression von EGFR, HER-3 und HER-4 in rectovaginalen und auch peritonealen Läsionen im Vergleich zu den jeweils anderen Läsionstypen.
EGF Rezeptoren nehmen Einfluss auf das Wachstum der Zellen. Der Proliferationsmarker Ki67 wird in der G1 bis hin zur M Phase des Zellzykluses exprimiert, aber nicht in der G0 Phase und kann somit als ein Marker für Zellproliferation und Wachstum genommen werden (Gerdes et al., 1984). Nicholson et al. untersuchten, ob die Expression der EGF Rezeptoren in Mammakarzinomen mit einer erhöhten Proliferationsrate (gemessen durch Ki67) der Tumorzellen zusammenhing. Nur für EGFR konnte ein Zusammenhang zwischen erhöhter Expression und erhöhter Proliferationsrate gefunden werden. Es wurde postuliert, dass HER-2, -3 und -4 indirekt Einfluss auf die Proliferation der Zellen nehmen
können, indem sie mit anderen Systemen, die das Zellwachstum regulieren wie dem ER System, interagieren (Knowlden et al., 1998; Nicholson et al., 1993). In unseren Untersuchungen konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Expression und der Expression von Ki67 gefunden werden, wenn gleich positive Tendenzen zu beobachten waren. Dies kann mit der zytoplasmatischen Lokalisation der EGF Rezeptoren zusammenhängen, die auf ein postaktives Stadium der EGF Rezeptoren hinweist. Andererseits können die EGF Rezeptoren auch, wie Nicholson postulierte, über andere Rezeptorsysteme indirekt Einfluss auf die Proliferation. Es ist mehrfach beschrieben und gilt als bewiesen, dass zwischen den EGF Rezeptor System und dem ER System ein enger cross talk besteht (Lee et al., 2001; Schiff et al., 2004; Smith, 1998). Der ER ist in den Epithelien aller von uns untersuchten Läsionen im Durchschnitt zu 92% und im Stroma zu 76% im Zellkern exprimiert (Abb.19). Es ist bekannt, dass Endometriose eine östrogenabhängige Erkrankung ist (Kitawaki et al., 2002), auch wenn die Ansprechbarkeit der Endometriosezellen auf Östrogen variabler ist als die der Endometriumzellen (Fujimoto et al., 1999). Dies führt zu ineffektiven Resultaten bei der endokrinen Behandlung der Endometriose, was zudem mit hohen Rezidivraten einhergeht (Scotti et al., 2000; Waller et al., 1993). Aufgrund dieser Tatsachen nimmt man an, dass andere Systeme neben dem ER System das Wachstum der Endometriosezellen und die Progression der Erkrankung unter Östrogenentzug sicherstellen. In Hinblick darauf haben wir die Expression der EGF Rezeptor Familie in Endometriose untersucht, da bekannt ist, dass dieses Rezeptorsystem auch in anderen hormonabhängigen Tumorarten als survival pathway fungiert (Salomon et al., 1995). Nicholson et al. beschrieben eine inverse Korrelation zwischen dem ERα und EGFR, bzw. HER-2 im Mammakarzinom (Nicholson et al., 2002). Auch unsere immunhistochemischen Untersuchungen zeigen eine statistisch signifikante Korrelation zwischen den epithelialen Expressionsmustern von ERα und EGFR, die einen inversen Charakter aufweist.
Allerdings konnte dieser Zusammenhang nur in den ovariellen Endometrioseläsionen gefunden werden. Da ovarielle Läsionen einer anderen Mikroumwelt ausgesetzt sind, die z.B. wesentlich höhere Steroidhormonkonzentrationen besitzt als die am Peritoneum (Koninckx, Kennedy et al., 1999), ist dies ein weiterer Hinweis darauf, dass das umgebende Milieu signifikante Einflüsse auf die Expression der EGF Rezeptoren hat. Wie vorher schon angesprochen stellen die hohen Rezidivraten von 50-75% innerhalb von fünf Jahren nach operativer und endokriner Behandlung ein
großes Problem in der Behandlung der Endometriose dar (Waller et al., 1993). Die sekundäre Tamoxifen (Antiöstrogen)-Resistenz im Mammakarzinom ist oftmals mit der inversen Expression von ERα und EGFR, bzw. HER-2 assoziiert. So scheinen die EGF Rezeptoren nicht nur als survival pathway, sondern auch im Zusammenhang mit der Entwicklung einer Antiöstrogen-Resistenz in diesem Tumor zu stehen (Britton et al., 2006; Schiff et al., 2004). So ist es möglich, die EGF Rezeptoren die Ausbildung einer endokrinen Resistenz in der Endometriose begünstigen. Um den Einfluss eines Östrogenmangels auf die Endometriosezellen zu analysieren, wurde erfolgreich ein in vitro-Modell der Endometriose entwickelt und zusätzliche Untersuchungen mit der Endometriosezelllinie 12Z unternommen. Alle vier Rezeptoren wurden in den epithelialen sowie in den stromalen Zellen mittels Doppelfärbung in unserem primären Zellkulturmodell nachgewiesen (Abb.10, 11). Da das Zellkulturmodell aus Endometrioma etabliert wurde, konnte HER-2 auch im Stroma nachgewiesen werden anlehnend an die immunhistochemischen Ergebnisse.
Die Downregulation des EGFR durch seinen Liganden EGF ist für verschiedene Gewebe in der Literatur beschrieben. Es wird angenommen, dass EGF eine interne Kontrolle für den Expressionslevel von EGFR darstellt und somit die EGFR vermittelten Effekte wie die Proliferation steuern kann (Carpenter et al., 1975;
Watson et al., 1994). Unsere Charakterisierung der primären Zellkultur zeigt eine Downregulation von EGFR bei Zugabe von EGF (Abb.15). Wir gehen also davon aus, dass das EGF Rezeptorsystem in unserem Zellkulturmodell funktionsfähig ist.
Die Regulierung der weiteren EGF Rezeptoren lässt sich über den cross talk der Rezeptoren untereinander erklären (Abb.16-18), allerdings ist die Funktionalität durch Zugabe anderer spezifischer Liganden nicht weiter belegt worden. Die Ergebnisse der Regulationsversuche zeigen, dass Östrogen einen direkten Einfluss auf die Expression von EGFR und HER-2 nimmt. Unter Östrogenmangel ist im in vitro-Modell eine Hochregulation des EGFR zu beobachten. HER-2 wird unter Östrogenmangel hingegen runterreguliert. So lässt sich auch in der Zellkultur ein enger cross talk zwischen dem EGF Rezeptor System und dem ER System beweisen. Als molekularer Mechanismus, der den cross talk zwischen dem ER System und anderen Signaltransduktionswegen steuert, wird die Phosphorylierung des ER postuliert (Lundholt et al., 2001). So konnte gezeigt werden, dass die MAP Kinase, die über die EGFR Signaltransduktionsweg aktiviert wird, den ER an der phosphoryliert und den Rezeptor somit aktiviert (Hynes et al., 2005). McClelland et
al. untersuchten die Expression von EGFR und ER in MCF-7 Brustkrebszellen, die mittels ICI 182 780 über drei Monaten in einem Östrogenentzug kultiviert wurden. Sie konnten zeigen, dass der ER runterreguliert wurde und das Zellwachstum über die EGF Rezeptor Signaltransduktionswege beeinflusst wurde (McClelland et al., 2001).
In unseren Versuchen wurden die Zellen nur 72h einem Östrogenentzug ausgesetzt.
Eine Hochregulation des EGFR, war deutlich zu erkennen, wohingegen keine Downregulation von ERα detektiert werden konnte. Es ist daher möglich, dass die Endometriosezellen erst über einen länger andauernden Östrogenentzug den ERα runterregulieren. Damit würde sich auch der in der Immunhistochemie festgestellte inverse Zusammenhang zwischen EGFR und ERα in den Epithelien der ovariellen Läsionen bestätigen. Die Ergebnisse der Regulationsversuche zeigen explizit, dass die Endometriosezellen EGFR und die damit zusammenhängenden Signaltransduktionskaskaden als survival pathway nutzen können und so auch Östrogenunabhängig proliferieren können. Obwohl keine direkte endokrine Regulation von HER-3 und HER-4 im in vitro-Modell gefunden werden konnte, können diese Rezeptoren dennoch indirekt auf die ER-Aktivierung Einfluss nehmen.
Da der ERα auch unter endokriner Therapie in den Endometrioseläsionen exprimiert wird, könnte er auch unter Östrogenmangel durch die EGF Rezeptoren aktiviert werden (Britton et al., 2006; Osborne et al., 2001). So kann, wie schon an anderer Stelle besprochen, die nukleare Form des HER-4 mit dem ERE im Nukleus interagieren und die ER-assoziierte Transkription verstärken (Junttila et al., 2005).
Neben seiner klassischen genomischen Aktivität, besitzt der ER auch eine nichtgenomische, über die auch EGFR aktiviert werden kann (Levin, 2001).
Andererseits kann ER auch durch eine Reihe von Kinasen, wie c-Src, Erk1/2 oder Akt phosphoryliert und damit aktiviert werden (Levin, 2005; Osborne et al., 2005).
Diese Kinasen gehören u.a. zu der EGF Rezeptor Signaltransduktionskaskade (Yarden,Sliwkowski, 2001). Somit können HER-3 und HER-4, auch wenn sie in unseren Regulationsversuchen nicht wie EGFR direkt von endokrin reguliert werden, großen Einfluss auf die Aktivierung des ER in endometriotischen Zellen nehmen.
Somit würden die EGF Rezeptoren auf zwei verschiedene Wege das Überleben der Zellen unter Östrogenentzug sichern.
Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das EGF Rezeptor System auf multiple Weise auf die molekularen Abläufe in Endometriosezellen Einfluss nimmt. Zudem bietet es den Endometriosezellen unter Östrogenentzug einen survival pathway, so
dass die Ausbildung eines aggressiveren Phänotyps unter endokriner Therapie und die hohen Rezidivraten der Endometriose im direkten Zusammenhang mit dem EGF Rezeptor System stehen können.
Diese Arbeit bietet eine gute Grundlage für eine weitere Erforschung der molekularen Netzwerke der Endometriosezellen und ihrer klinischen Auswirkungen in der benignen Tumorerkrankung der Endometriose.