Ribosomenuntereinheiten, was allgemein als Disaggregation der Polysomenkomplexe gewertet wird. Ein großer Teil der Transkripte liegt unter anhaltender Hypoxie als Ribonukleoprotein (RNP) Komplex vor 10 und ist demnach translationsinaktiv. In Untersuchungen an PC-3 Zellen konnten unter Hypoxie jedoch auch Transkripte nachgewiesen werden, die entgegen der allgemeinen Disaggregation der Polysomenkomplexe weiterhin stabil mit Ribosomen besetzt sind 56. 71 mRNAs, darunter unter anderem Ribonuclease, Laktatdehydrogenase A und Procollagen-Prolin, zeigten eine Anreicherung an Polysomen, jedoch keine Erhöhung des Proteinniveaus. Thomas & Johannes deuteten dieses Phänomen als eine Kompensation der ineffektiven Translationsrate der freien Polysomen im Zytosol.
Bei den zahlreichen Polysomengradientenanalysen, die zur Untersuchung der aktiven Proteinbiosynthese unter Hypoxie durchgeführt wurden, betrachtete man jedoch ausschließlich die freien – zytoplasmatischen - Polysomen. Das Endoplasmatische Retikulum, als Proteinsyntheseort, wurde dabei nicht berücksichtigt. Die Bedeutung des Endoplasmatischen Retikulums für die globale Proteinbiosynthese wurde in den letzten Jahren intensiv erforscht.
Etabliert ist die Annahme, dass die Translationsinitiation aller mRNAs im Zytosol startet und dass dieser Komplex, der mRNAs sekretorischer sowie membranständiger Proteine enthält, mittels eines als signal recognition particle (SRP) bezeichneten Signalweges an das rER rekrutiert wird um dort weiter translatiert zu werden 57-59. Es konnte kürzlich jedoch gezeigt werden, dass unter Normalbedingungen etwa 30% aller mRNAs am ER translatiert werden 42. Dabei kodieren viele dieser mRNAs auch für zytosolische und Kernproteine 60. Der andere, SRP-unabhängige, Weg ist die Ribosomen-unabhängige Direktrekrutierung. Dieses könnte beispielsweise über eine ER ständige mRNA oder über einen RNA Bindungsrezeptor erfolgen 61. Interessanterweise konnte eine 2,5 bis 4-fach höhere Proteinsyntheserate am ER gegenüber der Translation im Zytosol an sogenannten freien Polysomen (RNA-Ribosomen-Komplexe) nachgewiesen werden 62. Diese Befunde deuten an, dass die Rolle des Endoplasmatischen Retikulums in der Proteinsynthese mehr umfasst als die reine Translation sekretorischer und Membranproteine.
Um einen ersten Eindruck über die Verteilung der mRNA in einer hypoxischen Zelle zu erhalten, wurde in dieser Arbeit das Zelllysat aus humanen Fibrosarkomzellen (HT1080) nach einer zwei-minütigen Kurzzeit-Lyse (siehe Kapitel 2.2.1.) in zwei Kompartimente fraktioniert.
Das Sediment setzte sich unter anderem aus Zellkernen, Mitochondrien und Endoplasmatischen
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Retikulum zusammen. Der Überstand, welcher in ähnlicher Form auch für die Polysomengradientenanalyse verwendet wird, bestand aus zytosolischen Proteinen und freien Polysomen. In beiden Zellfraktionen, Zytosol und ER-haltig, sowie in Ganzzelllysaten wurden die Hypoxiemarker HIF-1α und Hexokinase2 sowie das Referenzgen β-Aktin nachgewiesen.
Die gesamt-β-Aktin mRNA Konzentration sinkt in HT1080 Zellen unter Hypoxie.
Darüber hinaus kommt es zu einer Verlagerung der Transkriptkonzentration ins Zytosol. Dieses Ergebnis konnte auch in MCF-7 Zellen gezeigt werden 50.
Die mRNAs der Hypoxie-sensitiven Gene HK2 und HIF-1α zeigten beide eine verstärkte Präsenz am ER unter Hypoxie. Während die Hexokinase2 mRNA Konzentration proportional auch im gesamten Fibroblasten ansteigt, bleibt die HIF-1α mRNA Menge insgesamt unverändert. Die Zunahme der in der Zelle vorhandenen HIF-1α mRNA am ER lässt sich durch eine Abnahme der Konzentration im Zytosol erklären. Bisher wurde die erhöhte Konzentration an HIF-1α Protein ausschließlich auf die Unterbrechung der Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Degradation zurückgeführt. Einen entscheidenden Einfluss auf die Proteinmenge könnte nach diesen Ergebnissen aber auch eine gesteigerte Translationsrate aufgrund der Translokation der HIF-1α mRNA zum Endoplasmatischen Retikulum haben.
Ein weiterer Hypoxie-induzierter Faktor ist die Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase α (I). Ihre mRNA Konzentration war unter Hypoxie stark gestiegen. Diese Erhöhung konnte auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Fähling beschrieb 2006, dass die Proteinmenge an P4Hα(I) im zeitlichen Verlauf stärker anstieg als deren mRNA Menge 40. D.h. die Translation unter Hypoxie ist effektiver. In den hier dargestellten Versuchen konnte vor allem eine stärkere Präsenz am ER gegenüber dem Zytosol gezeigt werden, was die aktive und erhöhte Translation am ER andeutet.
Ein weiterer getesteter Kandidat ist der Apoptosefaktor BLID (BH3-like motif-containing cell death inducer), dessen mRNA Menge in HT1080 Zellen unter Hypoxie induziert ist. Am ER zeigte sich jedoch keine signifikante Konzentrationsänderung im Vergleich zu Normoxie. Auch auf Proteinebene konnte keine Zunahme von BLID nachgewiesen werden. Die globale Erhöhung der mRNA kann als Kompensation für die ineffektive Translationsrate im Zytosol hypoxischer Zellen angenommen werden, was auch schon von Thomas & Johannes in ihren Versuchen an PC-3 Zellen postuliert wurde 56. Eine andere Möglichkeit ist, dass die Anreicherung von BLID mRNA im Zytosol, eine Vorbereitung auf eine mögliche Apoptose darstellt. Da der größere Anteil der BLID mRNA als translations-inaktiver RNP-Komplex vorliegt, ist eine schnelle Aktivierung der Translation, unabhängig von der Initiierung der Transkription, möglich und
kann eine sehr schnelle Erhöhung der BLID Proteinmenge bewirken. Diese Ergebnisse zeigen sehr deutlich, dass eine erhöhte mRNA Konzentration nicht mit einem Anstieg an Protein korrelieren muss.
Die These einer Verlagerung der aktiven Translation ans Endoplasmatische Retikulum wurde in Kooperation auch durch Untersuchungen der Experimental Research Unit der RHTW Aachen Universität gestützt. Durch Immunfloureszenzfärbung und In-situ-Hybridisierung (IS-FISH) konnte eine ER-Bindung (ER-Marker: Calnexin) der Hypoxie-induzierten mRNAs von VEGF-A, HIF-1α und C-P4Hα(I) nachgewiesen werden. Die Bindung an Ribosomen des ER konnte durch die Co-Lokalisation zu rpL19, einem ribosomalen Protein der 60S Untereinheit, bestätigt werden (unpublizierte Daten Staudacher et al.). Es wurden weiterhin β-Aktin und BLID mRNAs getestet. Diese zeigten, wie auch schon in den hier präsentierten Versuchen, eine verminderte Co-Lokalisation zu Calnexin und rpL19, was eine Abnahme der mRNA Konzentration am ER zeigt. Diese Resultate bestätigen unabhängig von den hier präsentierten Ergebnissen, dass eine erhöhte Genexpression Hypoxie-induzierter Gene mit einer selektiver Translation am ER assoziiert sind.
Bis hierhin kann bestätigt werden, dass ausgewählte Kandidaten (HIF-1, P4HA1, HK2), die als Hypoxie-induzierbare Gene verifiziert sind, unter Hypoxie eine erhöhte Präsenz am ER aufweisen. Andere Kandidaten (-Aktin, BLID) zeigen diese verstärkte Anreicherung am ER nicht, so dass eine regulierte mRNA Lokalisation am ER unter Hypoxie angenommen werden kann.
Um die Rolle des Endoplasmatischen Retikulums für die hypoxische Proteinbiosynthese und eine eventuelle Translokation der mRNA Translation ans ER nachweisen zu können, wurde der globale Zusammenhang zwischen Genexpression (Gesamt-RNA) und der mRNA/ ER-Lokalisation mittels Microarray Analyse betrachtet.
Zunächst wurde anhand typischer HIF-1 Zielgene die Hypoxieantwort der Genexpression in den verwendeten HT1080 Zellen qualitativ kontrolliert. HIF-1 aktiviert die Genexpression durch Bindung an hypoxia response elements (HREs) in der Zielgen-Promoterregion. Insgesamt sind bisher ca. 4000 Promoterregionen die HREs enthalten bekannt 63. Diese potenziellen Bindungsstellen können aufgrund von Acetylierung und Demethylierung der Histonenkonfiguration frei oder versperrt sein. Unter Hypoxie wirkt auch die Stärke und Dauer des Sauerstoffmangels auf diese Konfiguration. Die unterschiedliche Aktivierung der HIF-1
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Zielgene ist somit zelltypspezifisch. Semenza fasste in einem Übersichtsartikel 69 verifizierte HIF-1 Zielgene zusammen 17. 60 dieser Gene wurden in den HT1080 Zellen exprimiert. 32%
(19 von 60) wurden im hier durchgeführten Versuch signifikant unter Hypoxie induziert und stellen vor allem Gene des Glukosestoffwechsels, der Extrazellulär-Matrix, der Apoptose, der pH Regulation und der Angiogenese dar. Eine Aktivierung typischer HIF-1 Zielgene und die stattgefundene Hypoxiereaktion konnte damit als bestätigt angesehen werden. Nachfolgend wurde die Gesamt RNA aus Kontroll- und hypoxischen Zellen extrahiert um das allgemeine Expressionsverhalten darzustellen. Zur Darstellung der ER-Lokalisation wurde zunächst das ER der Zellen isoliert und anschließend die RNA extrahiert.
Als signifikant verändert wurden Datenpunkte angesehen, die das statische (Fold-Change, FC +/-1,4) und das dynamische (Z-score ≥ 3) Kriterium erfüllen. Zur Überprüfung dieser Signifikanzkriterien wurden mittels Realtime PCR (qPCR) acht ausgewählte Einzelkandidaten untersucht. Insgesamt wurde eine gute Übereinstimmung gefunden, wobei die qPCR sensitiver erscheint. Die für die Microarray Analyse getroffenen Signifikanzkriterien konnten als geeignet angenommen werden.
In der Microarray Analyse waren über 90% der exprimierten Gene unter Hypoxie nicht verändert, bzw. deren mRNA Konzentration blieb konstant. Signifikant verändert waren näherungsweise gleich viele Kandidaten (hochreguliert Gesamt-RNA 45,5%, bzw. ER-RNA 41,4%; herunterreguliert Gesamt-RNA 54,5%, bzw. ER-RNA 58,6%). Der überwiegende Teil der regulierten Gene wurde demnach in der Expression vermindert.
Besonders interessant ist, dass die Schnittmenge aus verstärkt exprimierten Genen (Gesamt-RNA) und RNAs, die unter Hypoxie verstärkt am ER lokalisiert waren, mit nur 31%
sehr gering ausfällt. 69% der Hypoxie-aktivierten Gene blieben am ER unverändert.
Demgegenüber waren 61% (296 mRNAs) stärker am ER lokalisiert, obwohl sich ihre Gesamtmenge nicht änderte. Ähnliche Verteilung konnte auch bei den reprimierten Genen (Schnittmenge 50%) gezeigt werden. Aufgrund der geringen Schnittmenge induzierter (bzw.
reprimierter) Gene, die sowohl auf der Expressionsebene als auch in ihrer ER-Lokalisation erhöht (bzw. vermindert) waren, kann man eine selektive Transkriptlokalisation am ER unter Hypoxie annehmen.
Um eine Einschätzung der Bedeutung dieser selektiven mRNA-Verteilung nachzugehen, wurde mittels Functional Enrichment Analysis nach Gemeinsamkeiten der Kandidaten in ihrer Funktion sortiert. Dabei wurde nach einer Anreicherung von signifikanten Genen in einer
Gruppe gesucht, die denselben Signalwegen zugeordnet werden. Es wurden Gene nach ihrer Expression sowie ihrer Lokalisation am Endoplasmatischen Retikulum unterschieden.
Eine Anreicherung von Kandidaten, die bekanntermaßen unter Hypoxie effektiv translatiert werden, konnte in der Gruppe gefunden werden, die sowohl verstärkt exprimiert als auch verstärkt am ER unter Hypoxie lokalisiert war. Kennzeichnend waren Gene Ontologies wie
„Hypoxia response“, „Glycolysis“ oder „HIF-1 transcription factor network“. Die Genexpression genau dieser Kandidaten wurde in einer Vielzahl von Publikationen als verstärkt beschrieben und kann daher als „aktiv translatiert“ angenommen werden 40, 64.
Für den Fibroblasten überlebenswichtig und deshalb auch in der Gesamtkonzentration an mRNA und speziell am ER induziert, waren vor allem Gene des HIF-1α Signalweges, der Glykolyse, der Glukoneogenese und des Glykogen Metabolismus. Auch induziert unter Hypoxie, aber nicht am ER lokalisiert, waren Gene, die an der Fettumsetzung sowie am Cholesterolumsatz und am Interleukin 3 Signalweg beteiligt sind. Lokale Hypoxie kann zu Entzündung des umliegenden Gewebes führen 65. Der Interleukin 3 Signalweg ist unter anderem an dieser Inflammationsreaktion sowie der T-Zell-gesteuerten Immunantwort beteiligt 66. Interessant ist, dass für Zellen wie den HT1080 Fibroblasten, die nicht an solchen Reaktionen mitwirken, der Hypoxie-induzierte Signalweg Interleukin 3 aktiviert wird. Die transkribierte mRNA aber nicht an den translationseffektiven Lokus ER transportiert wird. Es ist bekannt, dass Hypoxie eine ganze Kaskade an Genen aktiviert. Die Translokation ans ER kann bei dieser Aktivierung einen möglichen Filter für die zelltypspezifische Adaptation der Genexpression an Sauerstoffmangel darstellen. Aktivierte Gene, die nicht der zelltypspezifischen Funktionen dienen, werden ins translations-ineffektive Zytosol abgeschoben.
Herunterreguliert wurden vor allem Signalwege der Zellteilung, der oxidativen Phosphorylierung und der Atmungskette, was die typische Reaktion einer Zelle unter Sauerstoffmangel zeigt. MRNAs, die für Translationsfaktoren codieren, finden sich sowohl in der Gruppe „Nur ER-RNA vermindert“ sowie in „Nur ER-RNA erhöht“, was als Neuformatierung aufgrund der globalen Hemmung interpretiert werden kann. Eine Erklärung wäre das Umschalten am ER auf alternative Translationsinitiationsmechanismen aufgrund der hypoxischen Unterdrückung der regulären 5’-cap-abhängigen Initiation. Ein viel beschriebener Alternativweg ist die Translationsinitiation via Internal Ribosome Entry Sites (IRES) 67. Die ribosomale 40S Untereinheit bindet dabei an die IRES Struktur durch Vermittlung von
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sogenannten IRES transacting Faktoren (ITAFs). Bekannte Hypoxie-sensitive Gene, die IRES Elemente in ihrer 5’UTR aufweisen, sind VEGF A und HIF-1α 36, 68. IRES allein erklärt jedoch nicht die translatorische Kapazität hypoxischer Zellen. Eine weitere Möglichkeit die Translation einzuleiten beschrieb Uniacke. Ein Initiationskomplex aus dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4E2 (eIF4E2), HIF-2α und RNA Bindungsprotein (RBM4) lagert sich an die „hypoxia response element“ (HRE) Region der zu translatierenden mRNA an und assembliert mit deren 5’cap-Ende. Die Translation beginnt 69. Dieser Mechanismus selektiert während eines Sauerstoffmangels durch Anlagerung an die HRE Region die Hypoxie-sensitiven mRNAs.
Die Hemmung der unter Normalbedingungen stattfindenden 5’cap-abhängigen Initiation mit Coxsackie B Viren (CBV) Infektion zeigte die zu erwartende Hemmung der Proteinbiosynthese im Zytosol, jedoch eine stabile Translationsrate am ER 70. CBV spaltet den Translationsinitiationsfaktor eIF4G sowie das polyA-Bindungsprotein. Es konnte die Disassemblierung der zytosolischen Polysomen post contagionem gezeigt werden. ER-gebundene Ribosomen blieben währenddessen weiter mit der zu translatierenden mRNA assoziiert. Außerdem standen einige Ribosomen nach Termination der Neusynthese weiterer Proteine zur Verfügung unabhängig von der Anwesenheit einer signal recognition particle (SRP) vermittelten mRNA Signalsequenze.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Genexpression überlebenswichtiger, z.T.
HIF-1 abhängiger Prozesse, wie bspw. die Glykolyse, in hypoxischen Zellen gesteigert ist und dass diese Induktion mit einer gesteigerten mRNA Präsenz am ER korreliert ist. Es liegt demnach nahe, dass die Proteinsynthese unter Hypoxie vorrangig am ER stattfindet. Ob Mechanismen wie die IRES- oder 4E2:HIF-2:RBM4 Komplex abhängige Translationsinitiation bevorzugt am ER oder im Zytoplasma wirksam sind, muss in weiteren Studien geklärt werden.
Dazu könnte bspw. eine Quantifizierung der HIF-2 oder RBM4 Proteinmenge in der ER Fraktion nach Hypoxie dienen.
Ein weiterer post-transkriptioneller Regulationsfaktor, dem unter Hypoxie immer mehr Bedeutung zukommt, ist die microRNA (miRNA). Hierbei handelt es sich um kurze, nicht kodierende RNAs, die an bestimmten Stellen der 3’UTR der Ziel-mRNA binden und dessen Degradation oder Translationshemmung bewirken 71. Zur Zeit wird geschätzt, dass etwa 30% des humanen Genoms von miRNAs reguliert wird 72. Es sind bisher ~1000 miRNAs bekannt, wovon jede ~10 mRNAs beeinflusst 73. Veränderte miRNA Expression findet sich vielfach beschrieben
in der Tumorgenese 74-76. Ihre Regulation ist jedoch sehr zelltypspezifisch. Auf Translationsebene hemmen miRNAs die 5’cap-abhängige Initiation 77.
In den hier analysierten Microarrays konnten insgesamt 44 exprimierte miRNAs detektiert werden. Signifikant induziert waren jedoch nur miR21, miR196a-1 und miR221.
miR21 ist ein vielfach beschriebener Zellregulator. Er hemmt unter Hypoxie die Zellproliferation
78, hat Einfluss auf die Zelltransformation 75 und inhibiert Apoptose 79.
Interessant ist, dass eine einzelne miRNA ans ER rekrutiert wurde und allgemein nicht im Fibroblasten erhöht war: miR519a-2. Die Funktion von miR519 ist bisher noch relativ unbekannt. 2008 wurde eine direkte Hemmung der Biosynthese von humanem Antigen R (HuR oder ELAVL1) durch miR519 nachgewiesen 80. HuR fördert die Translation von Cyclinen, Wachstumsfaktoren und mitogenen Transkriptionsfaktoren. Indirekt könnte miR519 so die Proliferation der Zelle hemmen. Außerdem fördert miR519 durch Hemmung von HuR die IRES vermittelte Translationsinitiation 81.
Neben den miRNAs fand sich auch ein großer Anteil weiterer, nicht kodierender RNAs (ncRNAs), die unter Hypoxie signifikant verändert waren. Von den 625 Genen, die unter Hypoxie auf mRNA Ebene induziert waren, kodieren 70 nicht für Proteine. Unter den reprimierten Genen fanden sich nur vier sogenannte ncRNAs von insgesamt 737. Sehr interessant ist der Anteil an nicht regulierten ncRNAs, die unter Hypoxie vermehrt am ER nachweisbar waren. Er stellt mit 113 ncRNAs insgesamt 38,2% aller ans ER rekrutierten Transkripte. Am ER vermindert war nur eine ncRNA. In der Literatur finden sich wenige Publikationen, die sich mit unter Hypoxie regulierten ncRNA befassen 82. Die Veränderungen der Lokalisation von ncRNAs ist bislang unbeschrieben. Non-coding RNAs scheinen eine unbekannte aber wichtige Rolle in der Regulation der Translation unter Hypoxie zu spielen.
Dieses Phänomen sollte in zukünftigen Arbeiten weiter beleuchtet werden.
Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse lassen alle auf eine wichtige Rolle der Translation am ER unter Hypoxie schließen, die das Überleben der Zellen sicherstellt. Für Hypoxie-sensitive Gene, die insbesondere mit dem Energiestoffwechsel der Zelle assoziiert sind, konnte eine klare Favorisierung der Proteinsynthese am ER dargestellt werden - unabhängig von der mRNA Konzentration. Das ER könnte dabei als eine Art Filter für die zelltypspezifische Adaptation unter Hypoxie agieren. Aufgrund der unmittelbaren Nähe des ER zum Kern würde eine solche Selektion wesentlich kürzere mRNA Transportwege bedeuten. Außerdem wird ein kinetischer Vorteil aufgrund der zweidimensionalen Translation am ER gegenüber dem
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dreidimensionalen Translatieren an freien Ribosomen diskutiert 62. Gene bzw. deren mRNAs, die nicht unmittelbar für das Überleben benötigt werden, werden ins Zytosol verlagert. Es scheint als sei das Zytosol eine Art „Reservebecken“ für überproduzierte bzw. später benötigte mRNAs, wie im Falle von BLID. Bei der globalen Betrachtung waren Transkripte, die mit der allgemeinen Hypoxieantwort der Zelle im Zusammenhang stehen (GO: „Hypoxia response“, „Glycolysis“), am ER lokalisiert. Gene, die unter Hypoxie hochreguliert werden, für den HT1080 Fibroblasten aber keine überlebenswichtige Rolle spielen, werden nicht ans ER rekrutiert (beispielsweise der Interleukin 3 Signalweg). Nicht induziert, aber unter Hypoxie vermehrt am ER lokalisiert, sind vor allem Transkripte die für Translationsinitiationsfaktoren kodieren und ncRNAs. Es scheint eine Art Neuformatierung bzw. Umschalten aufgrund der Hemmung der regulären 5’cap-abhängigen Translationsinitiation zu geben. Der genauere Mechanismus der Translokation und Selektion zwischen den beiden Kompartimenten ER und Zytosol ist das Ziel zukünftiger Arbeiten. Auch ist interessant, welche Rolle dabei die nicht kodierenden RNAs spielen.
Das Verständnis rund um die genaue Adaptation an ein hypoxisches Umfeld ist wichtig für die protektive und kurative Therapie in der Prenatalentwicklung sowie der postnatalen Physiologie. In der Tumortherapie gelten die hypoxischen Bereiche durch Chemo- und Radiotherapie als uneffektiv behandelbar. Es ist wichtig neue Angriffspunkte zu finden und das Tumorwachstum und dessen Metastasierung durch gezielt lokale und selektive Therapie zu unterdrücken und Nebenwirkungen so gering wie möglich zu halten. Die Kenntnis über die zelltypspezifische Anpassung der Genexpression bzw. Ursachen der Hypoxie-Resistenz verschiedener Tumore bieten neue Therapieoptionen. Dabei wird die Kontrolle bzw. Regulation der mRNA Translation unter Hypoxie eine entscheidende Rolle spielen.
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