Diese Arbeit hatte zum Ziel, DNA verschiedener E. coli O157-Isolate zu typisieren und zu vergleichen. Mittels PFGE konnte ein großer Teil dieses Ziels erreicht werden. Bereits mehrfach konnte ein DNA-Figerprinting durch PFGE wichtige Beiträge zur Aufklärung epidemiologische Zusammenhänge bei E. coli O157-Isolaten leisten (ALLERBERGER et al., 2000; ALLISON et al., 1998; ALLISON et al., 2000;
BARKOCY-GALLAGHER et al., 2001; BÖHM und KARCH, 1992; COBBOLD und DESMARCHELIER, 2001; FEGAN und DESMARCHELIER., 2002; HEUVELINK et al., 1998a;
HEUVELINK et al., 2002; IZUMIYA et al., 1997; JOHNSEN et al., 2001; JOHNSON et al., 1995; WELINDER-OLSSON et al., 2000).
Die Identifizierung von Stämmen, die zu einem Klon gehören, ist eine wichtige Aufgabe der Infektionsepidemiologie. TENOVER et al. (1995) sowie GOERING (1998) berichteten, dass das entstandene RFM den Genotyp eines Bakterienstammes definiert. Miteinander verwandte Stämme einer Spezies werden anhand ihrer Ähnlichkeit im RFM erkannt. Der quantitative RFM-Vergleich erlaubt eine Definition von „Klon“ und „klonale Variante“ innerhalb einer Spezies. Schnittstellen für die Restriktionsenzyme sind selektionsneutrale Marker, die im Verlauf der Evolution des Bakterienchromosoms über „Rearrangements“ oder Mutationen an einer Stelle des Genoms verloren gehen und an anderer Stelle neu entstehen können. Die nicht miteinander verwandten Klone einer Spezies zeichnen sich durch unterschiedliche RFM aus, während die Varianten eines Klons sehr ähnliche oder identische RFM besitzen.
GOERING (1998) erklärte die verschiedenen genetischen Ereignisse, die auf das Genom einwirken können (Abbildung 5-1).
Abbildung 5-1: Überblick über verschiedene chromosomale genetische Ereignisse.
Darstellung von Insertionen (A-1, B-1), Deletionen (A-2, B-2) und
„Rearrangements“ (A-3, B-3) unter stattfindender (jeweils A) oder ausbleibender Einflussnahme (jeweils B) auf eine Restriktionsstelle im Genom; nach GOERING, 1998.
In einer weiteren Abbildung (Abbildung 5-2) interpretierte GOERING (1998) die nach Einwirkung dieser genetischen Ereignisse entstandenen RFM. Im Vergleich zu dem in der Mitte der Abbildung 5-2 gezeigten epidemiologischen verantwortlichen Referenzmuster üben die unter A-1 bis A-3 aufgeführten genetischen Ereignisse durch eine Veränderung einer Schnittsstelle des Genoms einen Einfluss auf das RFM aus. Die unter B-1 und B-2 dargestellten genetischen Ereignisse haben zwar keinen Einfluss auf die Schnittsstellen, bewirken jedoch durch Einfügen bzw. durch Entfernen von DNA-Abschnitten eine Änderung im RFM, während das unter B-3
Bakterienchromosom mit wenigen Schnittstellen
B-3
A-3
B-2
A-2
B-1 A-1
dargestellte „Rearrangement“ bzw. die Substitution einzelner Basen keinerlei Veränderung des RFM hervorrufen.
Abbildung 5-2: Darstellung des Einflusses genetischer Ereignisse auf die PFGE-Restriktionsfragmentmuster (nach GOERING, 1998):
Mitte = epidemiologisches Referenzmuster; A = genetische Ereignisse mit Einfluss auf die Schnittestelle und das Fragmentmuster; B = genetische Ereignisse ohne Einfluss auf die Schnittestelle sowie mit oder ohne Einfluss auf das Fragmentmuster.
Von BÖHM und KARCH (1992) wurde erstmals die Möglichkeit beschrieben, E. coli O157:H7-Stämme mittels Makrorestriktionsanalyse und anschließender PFGE sicher zu differenzieren. Sie prüften vier verschiedene Restriktionsenzyme, von denen sich XbaI als das geeignetste erwies. Die Auswertung geschah in diesem Fall mittels visuellen Vergleiches der Fragmentmuster, konnte aber auch durch Hilfe einer Software, wie die in den eigenen Untersuchungen verwendete „Gel Compar-Software“, vorgenommen werden. Diese Software rechnet die „similarity matrix“ oder den „similarity Koeffizient“ aus und präsentiert die Ergebnisse des RFM-Vergleichs in
(1) Insertion
(2) Deletion
(3) Rearrangement
oder Basen-substituition
PFGE-Referenz
-muster
(1) Insertion
(2) Deletion
(3) Rearrangement
oder Basen-substituition
A B
3 Banden- 3 Banden- 4 Banden- 2 Banden- 2 Banden- kein
Unterschied Unterschied
Form von Dendogrammen. RÖMLING et al. (1995) stellten fest, dass, wenn alle Stämme auf einem einzigen Gel analysiert werden können, der visuelle Vergleich der Fragmentlängenmuster in der Regel ausreicht. In den vorliegenden Untersuchungen wurde der Vergleich von Mustern verschiedener Gele benötigt. Deshalb wurde die visuelle Analyse und die Analyse mittels „Gel Compar-Software“ in Kombination durchgeführt.
Diese Methode und die sich daran anschließende Zuordnung der einzelnen Isolate zu einem RFM wurde in der Folge von verschiedenen Arbeitsgruppen vorgenommen.
Jedoch ließen sich bei der Interpretation der erhaltenen RFM durchaus Unterschiede feststellen. So ließen KRAUSE et al. (1996) eine Abweichung beim Matching der Fragmente untereinander von maximal zwei Prozent bei der Auswertung zu. Stämme mit einer „similarity matrix“ von mehr als 95 % werteten sie als identisch. Dies zeigt beispielhaft die Unterschiede in der Wertung der erhaltene Ergebnisse. Auch wenn die Standardisierung der PFGE als „Fringprint-Methode“ bereits weit fortgeschritten ist, so scheinen doch z. T. erhebliche Unterschiede in der Interpretation zu bestehen.
BÖHM und KARCH (1992) werteten, wie auch andere Arbeitsgruppen, zwei Isolate als nicht zum gleichen Klon gehörend, wenn sie sich in zwei oder mehr Fragmenten unterscheiden. TENOVER et al. (1995) bewerten die Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen anhand des unterschiedlichen Auftretens der Fragmente bei den Isolaten.
Erst ab dem Vorliegen von mehr als sieben Fragmenten, die nicht bei beiden Stämmen auftreten, werten sie diese Stämme als nicht miteinander verwandt.
Basierend auf TENOVER et al. (1995) bewerten KARIURI et al. (1999) Stämme mit einer
„similarity matrix“ von mehr als 60 % als „possibly closely related“ (wahrscheinlich eng verwandt). Nach GUTH et al. (2003) sind die Stämme als „possibly closely related“ klassifiziert, wenn sie eine „similarity matrix“ von ≥ 80 % zeigen. Anderseits behaupten WILLSHAW et al. (2001), dass die Interpretation der PFGE-Fragmentmuster noch subjektiv und die Differenzierungskriterien von TENOVER et al.
(1995) vielleicht nicht für EHEC O157-Stämme geeignet sind. Wie bereits erwähnt, wurde in den eigenen Untersuchungen die Auswertung der PFGE-Ergebnisse durch
„Gel Compar-Software“ und visuelle Analyse durchgeführt. Durch die Analyse des Dendogramms und die visuelle Auswertung zusammen mit der Ergebnissen der Typisierung der Verotoxin-Gene, biochemischer Tests und der Serotypisierung konnten die Stämme in Klone und klonale Varianten unterschieden werden.
In den vorliegenden Ergebnissen zeigen diejenigen E. coli O157 (darunter Referenzstamm EDL 933), die durch die visuelle Analyse der RFM-Gruppe A zugeordnet werden konnten, einen hohen Dice-Koeffizienten (76,7 ± 5,3%). Das bedeut, dass sich diese Stämme nur in wenigen Banden unterschieden. Zwischen diesen Stämmen zeigen sich wenige genetische Ereignisse, wie Insertion, Deletion und „rearrangement“, und sie gehören zum gleich Klon oder sind klonale Varianten.
BÖHM und KARCH (1992) fanden bei E. coli O157:H7 jeweils fünf identische Banden im Bereich zwischen 220 und 300 kb. Zwei Stämme bildeten hiervon jedoch eine Ausnahme, da sie jeweils sechs Banden in diesem Bereich zeigten. In eigenen Untersuchungen wurden abweichende Resultate erhalten: E. coli O157:H7 können drei, vier oder fünf Banden im Bereich zwischen 218 und 295 kb zeigen; in der Tat sind es jedoch in der Mehrzahl der Fälle fünf Banden. Noch im Bereich zwischen 25 und 73 kb wurden typische Banden gefunden. Eine Ausnahme bilden die untersuchten E. coli O157:H7-Isolate aus Rinderkot von Tieren einer Mutterkuhherde aus Rudlos: Diese zeigten unter anderem sechs Banden zwischen 220 und 300 kb (die zusätzliche Bande lag bei ca. 215 kb), eine fehlende Bande zwischen 25 und 73 kb, jedoch eine zusätzliche Bande mit 320 kb. Trotz dieser Unterschiede wiesen sie noch einen hohen Dice-Koeffizienten mit EDL 933 auf (von 75 % bis 78,9 %).
Teilweise stimmen die vorliegenden Ergebnisse jedoch mit denen von BÖHM und KARCH (1992) überein: Die XbaI-RFM-Analyse der typischen Banden erlaubt die Vermutung, dass es sich um E. coli O157:H7 handelt, ohne die Durchführung von O- und H-Serotypisierung und Verotoxintypisierung.
Die Untersuchung der Banden zwischen 25 und 73 kb kann durch Veränderung von Pulszeiten und –dauer unter Beibehaltung des Enzyms XbaI verbessert werden.
MURASE et al. (1999) empfiehlt für die Trennung von Fragmenten, die kleiner als 100 kb sind, eine konstante Pulszeit von 4 s für 20 h.
KARCH et al. (1993) behaupten, dass Sorbit- und ß-D-Glucuronidase-positive verotoxinogene E. coli O157:H- ein identisches oder eng verwandtes XbaI-RFM besitzen, das sich deutlich von dem andere E. coli-Stämme unterscheidet. Im Gegensatz dazu zeigten die Sorbit-negativen und ß-D-Glucuronidase-positiven verotoxinogenen E. coli O157:H- in den eigenen Untersuchungen das gleiche
XbaI-RFM wie die Sorbit- und ß-D-Glucuronidase-positiven verotoxinogenen E. coli O157:H- (z. B. Stämme 7579/95 und RL 105/96). Aber wie schon gezeigt, unterscheiden sich diese Stämme von Sorbit- und ß-D-Glucuronidase-negativen verotoxinogenen E. coli O157-Stämmen.
Hier muss eingeräumt werden, dass es sich bei den benutzten Restriktionsenzymen XbaI und SfiI um sog. „Rare-cutter“ handelt, die eine 6 Basen bzw. 13 Basen lange und damit relativ seltene Sequenz erkennen. Geringfügige Veränderung im Bakteriengenom außerhalb dieser Erkennungssequenzen führen nicht automatisch zu Veränderungen im Restriktionsmuster. Wie HARSONO et al. (1993) anhand von E. coli O157:H7 zeigten, können bei Anwendungen dieser zwei Enzyme diese Mutationen unter Umständen jedoch aufgedeckt werden. Bei unserer Arbeit wurde auch beobachtet, dass XbaI potentiell nützlicher für die Aufdeckung solcher Variabilitäten ist als SfiI. Das wurde z. B. durch die RFM-Ergebnisse der Stämme BU 1464/2 und BU 1464/3 demonstiert. Sie zeigen Unterschiede bei der XbaI-Analyse, wohingegen sie bei SfiI zum gleichen RFM gehören. Andererseits konnte in den eigenen Untersuchungen, wie auch bereits von HARSONO beobachtet, SfiI eine Variabilität aufzeigen, die mit Hilfe von XbaI nicht entdeckt werden konnte.
Beispielsweise zeigen Stämme des XbaI-RFM A4 zwei unterschiedliche SfiI-RFM.
Dennoch stehen HARSONOS Ergebnisse nicht im Widerspruch zur Klonalitätstheorie, sondern untermauern bei näherer Betrachtung diese These: Die ermittelten genomischen Unterschiede waren gering. Dies zeigte sich in Form von sehr ähnlichen Restriktionsmustern. Andererseits verwendeten RICE et al. (1999a) ebenfalls zwei Enzyme; sie behaupten, dass die Benutzung eines einzigen Enzyms zur Determinierung der Verwandtschaft zwischen E. coli O157 nicht ausreicht.
Die PFGE ist in der Lage, u. U. auch bei hoher genetischer Ähnlichkeit Unterschiede im Bakteriengenom aufzudecken. Jedoch wird diese Fähigkeit gerade bei Erregern klonalen Ursprungs eingeschränkt und durch einen extrem hohen finanziellen, zeitlichen und personellen Aufwand beim Verdau mit mehreren Restriktionsenzymen erkauft. So wäre ein Nachweis bestehender Mutationen zwar theoretisch möglich, jedoch nicht in jedem Fall, da stets nur Mutationen an der Enzymerkennungssequenz detektiert werden.
Wie schon in Abbildung 5-2 gezeigt wurde, führt die Deletion einer Base an der spezifischen Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms zum Verlust einer Schnittstelle: Zwei Fragmente bleiben zu einem größerem Fragment vereint. Entsteht durch Mutation eine neue Enzymerkennungsstelle, so kann das Restriktionsenzym dort schneiden: Ein Fragment wird in zwei kleinere geteilt. Findet eine Mutation hingegen im übrigen, weitaus größeren Genom statt, verändert sich das RFM nicht, und die Mutation kann nicht detektiert werden.
Ein anderer Nachteil der PFGE ist, dass manche Isolate nicht typisierbar sind. Bei fünf Isolaten trat dieses Problem auf (Daten nicht gezeigt). Das gleiche Problem wurde auch von anderen Autoren geschildert (IZUMIYA et al., 1997).
Als weiteres Problem fiel die Reproduzierbarkeit (Variabilität) der PFGE auf. Bei wiederholter Durchführung der PFGE des Stammes HC 2044 wurde nach Subkultivierung eine Bande weniger im RFM beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Dieses Phänomen wurde von IGUCHI et al. (2002) näher untersucht. Sie behaupten jedoch, dass trotz RFM-Veränderung die epidemiologisches „Lineage“ nicht zunichte gemacht werde. Andere Autoren haben dieses Phänomen ebenfalls beobachtet (BARKOCY-GALLAGHER et al., 2001; LIESEGANG et al., 2000).
Trotz aller geäußerter Kritikpunkte gegenüber der PFGE stellt sie dennoch ein wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung von Mikroorganismen und deren epidemiologischer Klassifizierung dar. Sie wird inzwischen als Standardmethode der Typisierung von E. coli O157 bezeichnet (IZUMIYA et al., 1997) und als beste Methode zur EHEC O157-Differenzierung klassifiziert (WILLSHAW et al., 2001).
Mit den Ergebnissen dieser PFGE-Analyse konnte bewiesen werden, was auch andere Autoren schon gezeigt haben: Der gleiche E. coli O157-Klon (identische oder ähnliche RFM) kann in verschiedenen Ländern gefunden werden. AKIBA et al. (2000) fanden sehr ähnliche Isolate in Rinderherden in den USA und in Japan. KESKIMÄKI et al. (1998) behauptete, dass ein einziger VTEC-Klon in viele Regionen Europas expandiert ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Isolate, die ähnliche oder identische RFM aufweisen, aus verschiedenen Ländern (USA,
Deutschland [verschiedene Regionen], Kanada, Dänemark, Schottland und Polen) stammen.
Zur Bestätigung, dass Wiederkäuer als Reservoir von EHEC O157-Stämmen anzusehen sind und dass ein aus Rinderkot stammendes Isolat durch fehlende Hygiene-Maßnahmen Lebensmittel kontaminieren kann und dadurch Menschen erkranken können, wurde der gleiche Klon (identische XbaI-RFM – XbaI-RFM A2) in Rinderkot (Stamm B 2482), in Lebensmitteln (Stamm D1 und BU 1464/3) und in Stuhl (Stamm 12/4) isoliert. Andere XbaI-RFM (RFM A4, A23, A34 und A37) wurden ebenfalls bei Isolaten aus Lebensmittel und Stuhl gefunden. Alle diese Befunden bestätigen, was auch andere Autoren schon gezeigt haben. LAHTI et al. (2001) hat identische RFM bei Stuhl- und Rinderkotisolaten gefunden, was die Vermutung stützt, dass Humaninfektionen durch bovine E. coli O157 hervorgerufen werden können. FEGAN und DEMARCHELIER (2002) bestätigten ebenfalls anhand von PFGE-Ergebnissen die Übertragung von E. coli O157 zwischen Menschen und Rindern.
BARKOCY-GALLAGHER et al. (2001) zeigten durch PFGE-Ergebnisse, dass Rinderschlachtierkörper durch Rinderkot der gleichen Charge kontaminiert werden.
Aus der Stuhlprobe eines Mitarbeiter eines fleischverarbeitenden Betriebes konnten vier verschiedene Stämme isoliert werden (Stamm 12/1, 12/4, 12/5 und 12/7). Sie weisen jedoch verschiedene XbaI-RFM auf und unterscheiden sich auch in der VT-Typisierung. Stamm 12/4 ist vtx1- und vtx2c-positiv, die Stämme 12/1, 12/5 und 12/7 sind vtx1- und vtx2-positiv. Ähnliches wurde auch bei den Kotproben dreier Tiere einer Mutterkuhherde festgestellt, allerdings nur im Hinblick auf Unterschiede in der PFGE. Das ließe sich entweder mit dem Phänomen des „clonal turnover“ erklären, das durch Mutation, "rearrangements" innerhalb des Genoms oder Verlust bzw.
Gewinn von Plasmiden entsteht, oder es gab eine Reinfektion oder eine doppelte Infektion (AKIBA et al., 2000;KARCH et al., 1995).
Die Behauptung von BÖHM und KARCH (1992), dass die PFGE zwischen verotoxin-positiven und verotoxin-negativen E. coli O157 (u. A. O157:H3, O157:H12, O157:16 und O157:H38) differenzieren könne konnte, abgesehen von zwei Ausnahmen, auch in der vorliegenden Untersuchung bestätigt werden. Die beiden VT-negativen Stämme NCTC 12900 und C 9 KJS weisen einen hohen Dice-Koeffizienten mit
Verotoxin-produzierenden E. coli O157 auf. Der Stamm NCTC 12900 gehört auch in der p-Gen-Analyse zum gleichen Profil (XVII) wie ein vtx2c-positives Isolat (Stamm 14/SLB). Die nicht-verotoxinogenen E. coli O157 gehören nicht zum gleichen Klon wie die verotoxinogenen E. coli O157.
Zum Stamm NCTC 12900 sollte noch ergänzt werden, dass er vermutlich einen hohen Dice-Koeffizienten mit Verotoxin-produzierenden E. coli O157 zeigte, weil er ein E. coli O157:H7 Stamm ist, der die Eigenschaft der Verotoxinbildung verloren hat (SKANDAMIS und NYCHAS, 2000).
Denkbar ist außerdem eine geringfüge Veränderung des RFM durch unterschiedliche Phagen und Phagenintegrationsorte sowie durch Variationen im Profil der beherbergten Plasmide. Diesen Ansatz versuchen SAMADPOUR et al. (1993) zu verwirklichen. Sie hybridisierten restringierte E. coli O157:H7-DNA mit λ-Bakteriophagensonden und konnten so Stämme verschiedener Ausbrüche unterscheiden, jedoch ohne eine Aussage über das eigentliche Bakteriengenom zu treffen. Später entwickelte DATZ et al. (1996) die p-Gen-Typisierung. Das p-Gen des VT2-konvertierten Phagen 933W von E. coli O157 Stamm EDL 933 ist 702 bp groß und besitzt eine 95,3 %ige Sequenz-Homologie mit dem p-Gen des λ-Phagen, was verdeutlicht, dass O157-Phagen Mitglieder der lambdoiden Bakteriophagenfamilie sind. Mittels DNA-Hybridisierung der E. coli O157-Stämme mit p-Gen-Sonden konnte die Anzahl von λ-Phagen (einschließlich vtx-Phagen) und deren Positionen im Genom dieser E. coli O157-Stämme bestimmt werden.
GemäßLIESEGANG et al. (2000) stellt die Typisierung von E. coli O157 mittels PFGE in Kombination mit der p-Gen-Typisierung ein Laborwerkzeug für die erweiterte epidemiologische Überwachung von E. coli O157:H7/H- dar.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass die p-Gen-Typisierung zur Differenzierung von E. coli O157-Stämmen nicht so gut geeignet ist wie die PFGE;
allerdings konnte diese Methode VT-positive von den VT-negativen Stämmen (Ausnahme: NCTC 12900 und E 205), die Sorbit-positiven oder Sorbit-negativen und ß-D-Glucuronidase-positiven Verotoxin-bildenden E. coli O157:H--Stämme von den Sorbit-negativen und ß-D-Glucuronidase-negativen Verotoxin-bildenden E. coli O157,
sowie die E. coli O157 mit typischen PFGE-Banden von den E. coli O157 ohne typische Banden (Ausnahme: Stamm NCTC 12900) unterscheiden.
Diese Ergebnisse stimmen mit denen von LIESEGANG et al. (2000) überein. Sie konnten ebenfalls Sorbit-fermentierende und ß-D-Glucuronidase-positive E. coli O157 von der Sorbit-und ß-D-Glucuronidase-negativen E. coli O157 mittels p-Gen-Typisierung differenzieren.
Die nicht-Verotoxin-bildenden E. coli O157-Stämme, die ein p-Gen-Profil zeigten (z.
B. Profil VII und XIV), konnten durch die Ergebnisse von DATZ et al. (1996) erklärt werden. Sie bewiesen, dass alle O157-Isolate ein analoges λ-Gen p, das nicht in Verbindung mit vtx1 und vtx2 steht, besitzen. Er arbeitete nur mit verotoxinogenen E. coli O157. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass nicht-verotoxinogene E. coli O157-Stämme nicht immer ein p-Gen besitzen, d. h. dass diese Stämme keinen λ-Phagen in ihrem Genom besitzen.
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, wiesen einige genotypisch identische Stämme verschiedene Serotypen auf; manche gehören zu E. coli O157:H7, andere zu O157:H-. Dieser Wiederspruch wurde z. B. zwischen den Stämmen B2482 und D1 sowie den Stämmen 740, R4, 654, 730 und 1204 bemerkt. Das konnten FIELDS et al.
(1997) erklären: Durch wiederholte Subkultivierungen kann ein Stamm, der ursprünglich beweglich war, seine Kapazität zur Expression des fliC-Gens, das für die H-Antigen-Kodierung verantwortlich ist, verlieren. Dann stellen sich H7-Stämme bei der Serotypisierung phänotypisch als unbeweglich dar.
In der vorliegender Arbeit wurde dann gezeigt, dass Verotoxintypisierung, RFLP mit p-Gen als Sonde und PFGE als Genotypisierungsschemata in Kombination mit klassischer Erregertypisierung, wie Sero- und Phänotypisierung, eine gute Methode ist, um E. coli O157-Stämme unterschiedlicher Herkunft zu charakterisieren.