Mit der vorliegenden Arbeit sollte zum einem eine umfassende Charakterisierung der IgE-bindenden Proteine der Tomate durchgeführt und ein Ansatz zur Isolierung dieser erarbeitet werden.
5.1 Charakterisierung der Tomatenallergene
Anhand einer SDS-PAGE mit anschließender immunochemischer Detektion unter Verwendung der 33 zur Verfügung stehenden Einzelseren wurden die IgE-bindenden Proteine der Tomate hinsichtlich ihres MG charakterisiert. Die anhand dieser IB erfolgten Aussagen über die Einteilung in Major, Intermediär- und Minorallergene entsprechend der Detektionsfrequenz der einzelnen Allergene innerhalb des Patientenkollektives ist lediglich als Tendenzangabe zu werten, da für eine gesicherte Aussage das relativ kleine Kollektiv von 33 sensibilisierten Patienten nicht ausreichend groß war. Nach GEHA et al. [1995] ist eine fundierte Klassifizierung erst ab einer Kollektivgröße von mindestens 50 Patienten möglich.
Entsprechend der Einteilungsdefinition eines Majorallergens, wonach über 50 % der Individuen eine IgE-Bindung zu einem Allergen aufweisen müssen [DREBORG et al. 1994], könnte es sich bei dem 44 kDa Allergen der Tomate um ein solches handeln. In dem untersuchten Patientenkollektiv besaßen 31 von 33 Seren spezifisches IgE gegen dieses Allergen und wiesen im IB eine intensiv gefärbte Bande auf. Im Rahmen der später durchgeführten Isolierung konnte dieses 44 kDa Allergen als Polygalacturonase 2A identifiziert werden. Auch RECHE et al.
[2001] beschrieben ein IgE-bindendes Protein mit einem MG von 44 kDa, welches im IB eine starke Färbung induzierte. Das von FÖTISCH et al. [2001] erwähnte Allergen mit einem MG von 43 kDa könnte ebenso mit Polygalacturonase 2A übereinstimmen. KONDO et al. [2001]
wiesen ein Majorallergen mit einem MG von 46 kDa nach, welches von 72.2 % der Seren detektiert wurde und ebenfalls als Polygalacturonase 2A identifiziert worden war. Somit ist das von KONDO et al. [2001] beschriebende 46 kDa Allergen mit dem nachgewiesenen 44 kDa identisch. Ein weiteres potentielles Majorallergen stellt das 70 kDa Allergen mit einer Detektionshäufigkeit von 51.5 % dar. Daneben treten weitere Allergene mit MG von 14, 26, 30, 36, 50 und 65 kDa, welche wahrscheinlich als Intermediärallergene angesehen werden können. Von weniger als 10 % der Seren wurden IgE-bindende Proteine mit MG von 18 und 28 kDa detektiert. Lediglich ein Serum wies spezifisches IgE gegenüber einem Allergen mit einem MG von ungefähr 9 kDa auf, welches dem in der Studie von FÖTISCH et al. [2001]
nachgewiesenen und als LTP identifizierten IgE-bindenden Protein mit dem gleichen MG entsprechen könnte. Generell stimmen die ermittelten MG weitgehend mit den in der Literatur angegebenen MG für die Tomatenallergene überein. PETERSEN et al. [1996] beschrieben diverse Allergene in einem MG-Bereich zwischen 18 und 70 kDa, wohingegen von KONDO et al. [2001] mehrere Allergene im Bereich von 14 und 46 kDa angegeben wurden. Dabei identifizierten KONDO et al. [2001] ein 22 sowie 25 kDa Allergen als ß-Fructofuranosidase, bei 18 kDa die Superoxid Dismutase sowie die Allergene mit einem MG von 14 und 34 kDa als Pectinesterase. Daneben beschrieben sie ein IgE-bindendes 16 kDa Protein, welches auch in der Studie von PETERSEN et al. [1996] erwähnt wurde, sowie ein weiteres bei 7 kDa. Im Gegensatz zu KONDO et al. [2001] wurde von FÖTISCH et al. [2001] für die ß-Fructofuranosidase ein MG von 50 kDa und für die Pectinesterase ein MG von 36 kDa angegeben. Anhand der Ergebnisse des IB der Einzelseren läßt sich eine erhebliche
Heterogenität der individuellen Sensibilisierungsspektren feststellen, wodurch auch die Differenzen der angegebenen MG der Tomatenallergene der verschiedenen Studien zu erklären sind.
Eine weitere Charakterisierung der Tomatenallergene erfolgte mittels IEF. Die dabei verwendeten Fertiggele ließen eine Auftrennung der Proteine in einem pHBereich von pH 3 -7 zu. In der unspezifischen Silberfärbung waren gut ausgebildete Proteinbanden mit pI von 3.8, 4.8, 5.0, 5.5, 5.8 und 5.9 erkennbar, wobei lediglich die Proteinbanden bei einem pI von 3.8, 5.8 und 5.9 eine IgE-bindende Aktivität aufwiesen. Anhand einer 2D-Elektrophorese konnten die Ergebnisse der IEF bestätigt und den pI ein MG zugeordnet werden. So konnte gezeigt werden, daß sich der pI der 44 kDa-Bande über einen pI-Bereich von 5.7 - 6.1 erstreckte und ebenso bei einem pI von 3.8 vorhanden war. Die 70 kDa Bande teilte sich in der zweidimensionalen Elektrophorese in vier Spots mit pI zwischen 5.9 und 6.0. Bei den Allergenen mit gleichen MG und verschiedenen pI könnte es sich um Isoallergene handeln, wobei die 2D-Elektrophorese lediglich als Hinweis auf eine potentielle Apparenz von Isoallergenen zu sehen ist. Für eine fundierte Klärung wäre eine Identifizierung dieser Allergene nötig. Den IgE-bindenden Banden mit einem MG von 26 und 36 kDa konnte jeweils ein pI von 5.8 zugeordnet werden. Das potentielle Profilin mit einem MG von 14 kDa, konnte in der 2D- Elektrophorese jedoch weder in der Silberfärbung noch im IB visualisiert werden.
Dies könnte darin begründet liegen, daß dieses Protein ein pI oberhalb 7 besitzt und somit durch das, in der ersten Dimension verwendete IEF-Gel, welches einen Trennbereich zwischen pH 3 und 7 besitzt, nicht aufgetrennt werden konnte. In der Literatur finden sich nur wenige Studien, welche die pI von Tomatenallergenen beschreiben. PETERSEN et al. [1996] beschrieb ein Allergen mit einem MG von 52 kDa und einem pI von 5.3, welches als ß-Fructofuranosidase identifiziert wurde. Zudem wurden von ihnen weitere 20 Allergene im Bereich zwischen pI 5.2 und 7.5 nachgewiesen, welche jedoch nicht genauer bestimmt wurden. FÖTISCH et al. [2001] gaben für ein Allergen, welches sie ebenfalls als ß-Fructofuranosidase identifizierten ein MG von 50 kDa an und ordneten diesem einen pI Bereich von 4 bis 4.5 zu. Des weiteren beschrieben sie insgesamt vier IgE-bindende Proteine mit einem MG von 36 kDa, wovon drei als Isoallergene der Polygalacturonase 2A bezeichnet wurden und im pI-Bereich zwischen 6.8 und 7.5 auftraten. Dem vierten, als Pectinesterase identifizierten 36 kDa Allergen, wurde ein pI von 9.3 zugeordnet. Wie schon im Allergenspektrum der SDS-PAGE können die verschiedenen pI und MG auch hier über die Verwendung von Seren unterschiedlich sensibilisierter Individuen erklärt werden. Hinzu kommt des weiteren die Verwendung verschiedener Trennsysteme in der IEF. So wurde die IEF in der Studie von PETERSEN et al.[1996] in einem pH-Gradienten von 3.6 - 9.3 durchgeführt, wohingegen die Trennung von FÖTISCH et al. [2001] in einem Bereich von pH 3 bis 10 erfolgte. Das in dieser Studie verwendete IEF-Gel ermöglichte die Trennung im pH-Bereich von 3-7.
Anhand zehn verschiedener Tomatensorten wurde eine potentielle Sortenabhängigkeit des Allergenspektrums und der allergenen Aktivität untersucht. Bei der Auswahl der Tomatensorte wurde darauf geachtet, daß ein relativ breites Spektrum verschiedener Phänotypen abgedeckt wurde. Als Vertreter der Cherrytomate wurden die Sorten «El Salvador» und «Sweet million»
eingesetzt, wohingegen «Togo Trefle» ein Vertreter der Fleischtomate darstellt. «Flamme» und
«Estrella» sind typische Stabtomaten, während die Sorten «Roma» und «Balkonstar» zu den
Buschtomaten gezählt werden. Obwohl die genaue Sortenbezeichnung der «unbekannte Sorte» nicht bekannt war, gehört sie ebenso wie die Sorte «Tasty Tom» zu den Strauchtomaten.
Im Gegensatz zu sämtlichen anderen Sorten war die Sorte «Yellow King» im reifen Zustand von leuchtend gelber Farbe. Im Gesamtproteinmuster der SDS-PAGE zeigten sich geringfügige Unterschiede im Proteinmuster zwischen den einzelnen Sorten, die hauptsächlich auf einer unterschiedlichen Intensität der einzelnen Proteine basierten. Das Allergenspektrum war fast identisch; doch auch hier konnten leichte Differenzen festgestellt werden. So wurden die allergenen Banden mit MG von 26, 28 und 30 kDa nicht in jeder Tomatensorte nachgewiesen. Allerdings standen die Unterschiede in keiner Relation zu den Phänotypen der verschiedenen Sorten. In der IB-Inhibition, bei welcher jeder Extrakt festphasengekoppelt und als Inhibitor eingesetzt wurde, zeigten jedoch alle Sorten ein identisches Inhibitionsvermögen.
Dies ließ darauf schließen, daß die in nicht jeder Sorte vorhandenen Allergene identische oder zumindest große Homologien zeigen. Die zu erkennenden Unterschiede im Proteinmuster bzw. im Allergenspektrum der verschiedenen Tomatensorten könnten durch die jahrelang erfolgten Züchtungsversuche erklärt werden, wodurch es zur Anreicherung bzw. Reduzierung verschiedener Proteine gekommen sein kann. In der EAST-Inhibition zeigte der Extrakt der Sorte «Balkonstar» im Vergleich zu allen anderen Sorten eine leicht erhöhte allergene Potenz.
Die allergene Aktivität aller anderen Tomatensorten ist dagegen miteinander vergleichbar.
Ähnliche Ergebnisse konnten von JENSEN-JAROLIM et al. [1998] in der botanisch verwandten Paprika festgestellt werden. Von acht untersuchten Paprikasorten konnte lediglich in fünf Sorten ein Protein bzw. Allergen mit einem MG von 23 kDa nachgewiesen werden. Eine Untersuchung hinsichtlich des allergenen Potentials wurde in dieser Studie jedoch nicht durchgeführt. Entsprechend diesen Ergebnissen konnten auch in der Kartoffel Differenzen im Protein- sowie Allergenspektrum unterschiedlicher Sorten festgestellt werden [SCHUBERT et al.
submitted]. Anhand einer EAST-Inhibition zeigten sich dagegen keine Unterschiede bezüglich der allergenen Potenz. Im Gegensatz dazu konnten erhebliche Differenzen der allergenen Aktivität verschiedener Apfelsorten festgestellt werden [VIETHS et al. 1993b, 1994a & HSIEH et al. 1995]. Die jüngeren Zuchtsorten wie «Golden Delicious» und «Granny Smith» zeigen eine stärkere Allergenität als die Apfelsorten «Boskoop», «Gloster» und «Jamba». VIETHS et al.
[1994a] und SON et al. [1999] konnten in diesem Zusammenhang die Korrelation zwischen der allergenen Potenz und der Konzentration des Hauptallergens Mal d 1 belegen. Im Gegensatz dazu konnten KINDER et al. [1999] anhand von vier Mangosorten keine Sortenabhängikeit feststellen. Zu dem gleichen Ergebnis führten die Untersuchungen von ZUNKER [2001] an Mangos und Litchis. Ebenso zeigten WIGOTZKI et al. [2000], daß verschiedene Haselnuß- bzw. Karottensorten das gleiche Protein- bzw. Allergenspektrum und keine Unterschiede in ihrer Allergenität aufweisen.
Die Untersuchung des allergenen Potentials während des Reifungsprozesses wurde an den Sorten «Balkonstar», «Sweet million» und «Togo Trefle» durchgeführt, welche jeweils in vier verschiedenen Reifestadien geerntet wurden. Alle drei Sorten zeigten eine Zunahme der allergenen Potenz mit fortschreitendem Reifegrad. Anhand der unspezifischen Färbung wurde eine Konzentrationszunahme verschiedener Proteine beobachtet, welche sich ebenso im IB wiederspiegelte. Die Färbung der allergenen Banden mit einem MG von 26, 30 und 44 kDa war in den reifen, roten Früchten deutlich intensiver als in den unreifen. Über den Konzentrationsanstieg dieser Allergene könnte eine Zunahme der allergenen Potenz erklärt werden. Diesen Ergebnissen entsprechend beschrieben auch KONDO et al. [2001] einen
Anstieg der Allergenkonzentration während des Reifungsprozesses. Sie dokumentierten in den reiferen Früchten ebenfalls einen höheren Gehalt der Polygalacturonase 2A (46 kDa) sowie eines als ß-Fruktofuranosidase identifiziertes 25 Allergen, welche mit den 26 kDa-Allergen übereinstimmen könnte. Daneben beschrieben sie eine Steigerung des Gehaltes der Pectinesterase mit einem MG von 14 kDa. Diese Ergebnisse stimmen damit überein, daß die Polygalacturonase 2A zusammen mit der Pectinesterase am Reifungsprozeß der Tomate beteiligt ist [BIRD et al. 1988]. Im Gegensatz dazu begründeten BLEUMINK et al. [1967] die ebenfalls festgestellte Zunahme der Allergenaktivität von Tomaten durch die Entstehung neuer Allergene durch die Maillardreaktion. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie jedoch nicht bestätigt werden. Anhand des Apfels konnten VIETHS et al. [1993b] und HSIEH et al.
[1995] eine Zunahme der allergenen Potenz während der Reifung feststellen, wobei diese in Relation zur Konzentrationszunahme des Hauptallergens Mal d 1 stand. Dagegen wurden von PASCHKE et al. [2001] sowie ZUNKER [2001] keine Allergenitätsveränderungen in reifenden Mangos nachgewiesen.
Zudem wurde die Allergenverteilung innerhalb der Tomatenfrucht an den Sorten «Estrella»,
«Flamme» und «Roma» untersucht, wobei die Tomate in ihre Bestandteile Schale, Fruchtfleisch, Plazenta, Pulpa und Samen aufgeteilt worden ist. FERNANDEZ-RIVAS & CUEVAS [1999] konnten bei den der Familie der Rosaceae zugehörigen Früchten Apfel, Birne und Pfirsich eine erhöhte allergene Potenz der Schale gegenüber dem Fruchtfleisch feststellen. Auch FUNES et al. [1999]
dokumentierten im Fruchtfleisch der Früchte der Anacardiaceae andere IgE-bindende Proteine als in der Schale. PASTORELLO et al. [1999] konnten nachweisen, daß sich die in einer Vielzahl von Pflanzen vorkommenden und allergenen LTP in den Schalen der Früchte anreichern. Im Gegensatz hierzu konnten in der Kartoffel, welche mit der Tomate phylogenetisch verwandt ist, keine Differenzen der IgE-Bindung zwischen Mark und Schale festgestellt werden [SEPPÄLÄ et al. 1999; CASTELLS et al. 1986]. Ebensowenig führt die ungleichmäßige Reifung der klimakterischen Mangofrucht zu einer heterogenen Verteilung der Allergene innerhalb der Frucht [ZUNKER 2001]. Die durchgeführten Untersuchungen wiesen allerdings auf eine heterogene Allergenverteilung innerhalb der Tomatenfrucht hin. Während in der Schale ausschließlich das 44 kDa-Allergen vorhanden war, konnte dieses im Samen nicht detektiert werden. Dafür wies der Samen zusätzliche, im Gesamtextrakt der Tomate nicht detektierbare Allergene auf. In der IB-Inhibition, bei welcher der Extrakt des Samens festphasengebunden vorlag, konnte zudem gezeigt werden, daß die Allergene mit einem MG von 16, 33 und 60 kDa nur in der Pulpa und im Samen vorkommen und zudem im Vergleich zu den anderen in der Tomatenfrucht apparenten Allergenen verschiedene Epitope tragen. Die Differenzen konnten anhand der IEF verifiziert werden. Die pI der Allergene des Samens lagen im Gegensatz zu allen anderen Fruchtbestandteilen bei einem pI von 6.0 und im Bereich von 4.8 - 5.7. Zudem konnte die in der Gesamtfrucht bestimmte Bande bei pH 3.8 in keinem anderen Fragment als in der Schale nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Tomatenbestandteile mittels EAST-Inhibition zeigte eine deutlich niedrigere Allergenität des Samens gegenüber allen anderen Fragmenten. Die im Samen vorliegenden abweichenden Proteine bzw. Allergene könnten über die Funktion des Samens erklärt werden. So enthält der Samen im Gegensatz zu den anderen Fruchtbestandteilen die zur Erstentwicklung einer neuen Pflanze benötigte Nährstoffreserve, die sich aus Kohlenhydraten, Proteinen und Fetten zusammensetzt [FRANKE 1997].
Anhand eines gegen rekombinantes Birnenprofilin gerichteten Antikörpers wurde die Präsenz von Profilinen in den unterschiedlichen Tomatenfragmenten untersucht. Diese ubiquitär vorkommenden Proteine werden als kreuzreagierende Allergene in pflanzlichen Ressourcen angesehen. Sie konnten in einer Vielzahl von Pflanzen bereits als Minorallergene nachgewiesen werden, wobei jeweils ein einheitliches MG von ca. 14 kDa angegeben werden konnte [VALENTA et al. 1992a, 1992b; VAN REE et al. 1992, 1995; VALLIER et al. 1992;
MARTINEZ et al. 1995; EBNER et al. 1995; VIETHS et al. 1995b; BAUER et al. 1996; JANKIEWICZ et al. 1996, 1997, 1998; DANSCHER et al. 1998; LEITNER et al. 1998; DÍEZ-GÓMEZ et al. 1999].
Zudem sind die IgE-bindenden Epitope der Profiline durch eine hochkonservierte Sekundär-bzw. Tertiärstruktur determiniert [ORTOLANI et al. 1993]. Im Rahmen dieser Studie konnte in der Tomate das 14 kDa Allergen als Profilin identifiziert werden, wobei dieses in der Schale sowie in der Pulpa nicht zugegen war. DARNOWSKI et al. [1996] vermuteten als erste das Vorhandensein von Profilinen in der Tomate. PETERSEN et al. [1996] und FÖTISCH et al. [2001]
identifizierten eine 16 kDa Allergen als Profilin, wohingegen FUCHS et al. [2002] für das Tomatenprofilin nach erfolgter Klonierung ein MG von 14.252 kDa angaben und dieses als Lyc e 1 bezeichneten. In der vorliegenden Arbeit wiesen 16 der 33 Patienten, d.h. 48.5 %, eine Sensibilisierung gegenüber dem Profilin auf, welches in guter Korrelation zu den Ergebnissen von FÖTISCH et al. [2001] steht, in welcher 44 % der Patienten auf das Profilin reagierten. Über die Verteilung von Profilin innerhalb der Frucht sind bislang noch keine Untersuchungen bekannt.
Als weitere kreuzreagierende Struktur zwischen phylogenetisch nicht verwandten Organismen werden die CCD diskutiert [AALBERSE 1981]. Um potentielle Glycoproteine zu identifizieren und deren Relevanz als Allergene zu verifizieren, kamen verschiedene Methoden zum Einsatz.
Mittels der PAS-Färbung konnten in der Tomate vier Glycoproteine mit MG von 20, 26, 36 und 44 kDa visualisiert werden. Dieses Resultat wurde durch eine Periodatspaltung, bei welcher eine Zerstörung der Kohlenhydrate erfolgte, verifiziert. Bei der anschließenden immunochemischen Detektion unter Verwendung des Poolserums war zum einem eine Schwächung der 26 kDa und 44 kDa-Bande erkennbar. Zum anderern hat die Periodatbehandlung zur Eliminierung der IgE-Bindungsfähigkeit des 36 kDa Allergens geführt.
Die Detektion aller anderen Allergene erfolgte unverändert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß die Allergene mit den MG von 26, 36 und 44 kDa CCD tragen könnten. Da die Allergenbanden bei 26 und 44 kDa nur geschwächt worden sind, wäre es möglich, daß diese Proteine neben potentiellen CCD weitere, nur durch Proteine gebildete Sequenz- bzw.
Konformationsepitope tragen. Allerdings können diese Ergebnisse nur als Hinweise auf eine mögliche CCD gewertet werden, da die Periodatbehandlung ebenso eine Veränderung von oxidationsempfindlichen AS zur Folge haben könnte, woraus ebenfalls eine Zerstörung des Epitops resultieren würde. Die Apparenz von CCD auf den Allergenen der Tomate wird durch die Ergebnisse von ZELENY et al. [1999] bestätigt. Sie charakterisierten die Struktur der gebundenen Oligosaccharide der Tomate und konnten zeigen, daß bei der Mehrheit der N-Glycane an dem terminalen N-Acetylglycosamin ein α-1,3-Fucose-Rest vorliegt. Von GARCIA -CASADO et al. [1996], WILSON & ALTMANN [1998] und PETERSEN & MUND [2001] konnte die IgE-bindende Potenz der α-Fucose nachgewiesen werden. BLEUMINK et al. [1966,1967]
beschrieben die Isolierung einer nicht näher charakterisierten Fraktion der Tomate mit einem hohen allergenen Potential, welche aus Glycoproteinen mit MG zwischen 20 und 30 kDa bestand. Eine Periodatbehandlung führte in der Studie von PETERSEN et al. [1996] zu einer
drastischen Reduzierung der IgE-bindenden Proteine, wobei lediglich das Profilin noch detektierbar war. Eine sensiblere Methode zum Nachweis von Glycoproteinen stellt die spezifische Detektion durch die Verwendung von Lectinen dar. Der Nachweis erfolgte mittels Lectin-Blot, bei welchem die HRP- konjugierten Lectine Con A, PNA und RCA zur Verfügung standen. Während das Lectin PNA keine Bindungsaktivität aufwies, zeigt RCA, welches spezifisch auf α- und β-Galactose reagiert, schwache Bindungen an Glycoproteine mit MG von 20 kDa sowie zwischen 36 und 70 kDa. Eine Inkubation mit dem Lectin Con A resultierte in einer Detektion von einer Vielzahl von Proteinen im Bereich von 18 - 70 kDa. Der Vergleich mit dem Allergenspektrum läßt vermuten, daß es sich bei den Allergenen um Glycoproteine handelt, bei welchen α-Mannose, α-Glucose bzw. N-Acetylglucosamin glycosidisch gebunden sind. Der Nachweis potentieller Glycoproteine wurde zudem unter Verwendung der AC, bei welcher die Lectine RCA bzw. WGA als Liganden fungierten, durchgeführt. Die von den Lectinliganden retardierten Glycoproteine wurden nach erfolgter Elution von der Säule elektrophoretisch getrennt und unspezifisch sowie immunologisch detektiert. Das unspezifisch visualisierte Eluat der RCA wies Proteine im Bereich zwischen 20 und 70 kDa auf. Im Gegensatz zum RCA-Lectinblot konnten die Proteine intensiver detektiert werden, welches jedoch in der Konzentrierung des Extraktes nach erfolgter AC begründet liegt. Von diesen Glycoproteinen konnte lediglich ein Protein bei 30 kDa als Allergen identifiziert werden. Eine Vielzahl von Proteinen im gesamten MG-Bereich von 14 bis 94 kDa zeigte eine Bindungsaffinität zum Lectin WGA, wobei auch hier lediglich das 44 kDa-Allergen als Glycoprotein nachgewiesen werden konnte. Daneben konnte das 44 kDa-Allergen jedoch auch im Durchlauf der WGA-AC nachgewiesen werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß die im IB bei 44 kDa sichtbare Bande durch mehrere, unterschiedliche IgE-bindende Proteine hervorgerufen wird. Es wäre aber auch denkbar, daß es sich um das gleiche Protein handelt, welches unterschiedliche Kohlenhydratketten trägt. Dies stimmt mit dem Ergebnis der 2D-Elektrophorese überein, bei welcher sich die Spots mit einem MG von 44 kDa über einen pI-Bereich von 3.8 bis 6.1 verteilten. Diese Verteilung könnte zum einen über leichte Unterschiede in der AS-Sequenz oder über unterschiedliche Kohlenhydratketten erklärt werden. Der Nachweis von Kohlenhydraten des 44 kDa-Allergens, welche später als Polygalacturonase 2A identifiziert wurde, steht dabei im Einklang mit der molekularen Charakterisierung dieses Proteins durch GRIERSON et al. [1986] und SHEEHY et al. [1987]. Sie konnten zeigen, daß die Polygalacturonase 2A an vier Stellen eine N-glycosidische Bindung aufweist. FÖTISCH et al. [2001] dokumentierten Glycoproteine in der Tomate über den MG-Bereich 20 - 94 kDa. Sie beschrieben, daß die meisten Allergene der Tomatenfrucht, mit Ausnahme der Proteine mit MG 23, 40 und 43 kDa, in ihrem Epitopaufbau Glycostrukturen tragen. PETERSEN & MUND [2001] konnten unter Verwendung des Lectins Aleuria aurentia Agglutinin (AAA), welches α-Fucose spezifisch zu binden vermag, mehrere Glycoproteine detektieren. Dabei wurden auch Banden >65, 35 - 45, 31 und 25 kDa visualisiert, welche auch im IB vorhanden waren und somit eine IgE-bindende Aktivität aufwiesen. Da α-Fucose als IgE-bindende Struktur angesehen wird [GARCIA-CASADO et al. 1996; WILSON & ALTMANN
1998; PETERSEN & MUND 2001], wird vermutet, daß die IgE-Reaktivität der eben beschriebenen Allergene auf dem Vorkommen von Kohlenhydratdeterminanten basieren könnte. Dies steht in Übereinstimmung mit der durchgeführten Periodatspaltung, bei welcher die IgE-Bindungsfähigkeit des 26 und 44 kDa Allergens, welche dem 25 und 43 kDa-Allergen entsprechen könnten, geschwächt wurde. Zudem könnte das von PETERSEN & MUND [2001]
beschriebene 35 kDa-Allergen mit der allergenen Bande bei 36 kDa, welche nach der Periodatbehandlung nicht mehr apparent war, übereinstimmen.
Im Rahmen zur Stabilitätsuntersuchung gegenüber proteolytischen Enzymen der Tomatenallergene wurde eine einfache Simulation des menschlichen Verdauungstraktes durchgeführt. Dadurch sollte geklärt werden, ob durch die Tomatenallergene eine Sensibilisierung des Immunsystems über den gastrointestinalen Trakt erfolgen kann. Nach ASTWOOD et al. [1996] und TAYLOR [1992] ist eine Sensibilisierung des Organismus nur dann möglich, wenn die Allergene die Magenpassage des Verdauungstraktes mit intakten Epitopen überstehen. Daher wird die Proteinstabilität gegenüber der enzymatischen Verdauung auch im Rahmen einer Sicherheitsbeurteilung von genetisch veränderten Pflanzen untersucht [FUCHS et al. 1993; REED et al. 1996]. Eine Auslösung von schwachen klinischen Symptomen wie dem OAS ist jedoch nicht an eine Persistenz der Allergene gegenüber der proteolytischen Spaltung gebunden, sondern kann ebenso über potentiell vorhandene Kreuzreaktivitäten der Lebensmittel zu Pollenallergenen erfolgen. Ein Beispiel hierfür stellt die birkenpollenassoziierte Haselnußallergie dar. VIETHS et al. [1999] konnten einen weitgehenden Abbau der Allergenaktivität bzw. der Allergene der Haselnuß nach erfolgter Pepsinbehandlung feststellen.
Die trotzdem auftretenden klinischen Symptome, welche sich fast ausschließlich auf das OAS beschränkten, erklärten sie über die Kreuzallergenität zu Birkenpollen. Gegenüber den in der Literatur beschriebenen Studien, in welchen lediglich eine Simulation der Magenverdauung mit Pepsin erfolgte [ISHIZAKA et al. 1960; MATSUDA et al. 1983; ASTWOOD et al. 1996], wurde dem Magenverdau eine in vitro Darmverdauung unter Verwendung der Enzyme Trypsin, Pankreatin und Proteinase K angeschlossen. Die für die simulierte Magenverdauuung verwendete Pepsinaktivität sowie die Variation der Inkubationsdauer orientierte sich an den von ASSELIN
[1989], ASTWOOD et al. [1996] und MATSUDA et al. [1983] gewählten Parametern. Bereits beim Eintritt in den Magen kann es durch den niedrigen pH-Wert zur Hydrolyse der Proteine kommen, so daß neben der Inkubation mit verschiedenen Pepsinkonzentrationen die Einwirkung des pH-Wertes auf die Tomatenproteine untersucht wurde. In dem Extrakt der nur mit Säure behandelten Tomate konnten keine Unterschiede des Allergenspektrums im Vergleich zur nativen Tomate festgestellt werden. Zudem konnte mittels der EAST-Inhibition eine identische Allergenaktivität nachgewiesen werden. Einen geringfügigen Einfluß eines sauren Mediums auf die Allergene konnten BARNETT & HOWDEN [1986] an einem Glycoprotein der Erdnuß sowie KORTEKANGAS-SAVOLAINEN et al. [1983] an Hefeallergenen nachweisen.
HONMA et al. [1994] stellten eine unveränderte Allergenität des Ovalbumins aus dem Hühnerei bis pH 3.0 fest. Die Einwirkung von Pepsin auf die Tomatenallergene induzierte einen deutlichen Abbau mehrerer Proteine, lediglich die Allergene bei 18, 36, 44 und > 70 kDa waren stabil. Die in der unspezifischen Silberfärbung detektierten neuen Banden im unteren MG-Bereich zeigten keine IgE-bindende Reaktivität. Eine Erhöhung der Enzymaktivität hatte eine weitere Hydrolyse der Allergene zur Folge. Während die allergene Bande bei einem MG von 36 kDa nicht mehr apparent war, konnte eine neue Bande mit einem etwas geringeren MG von ca. 30 kDa detektiert werden. Dies läßt die Vermutung zu, daß es sich bei der neuen Bande um ein Fragment des 36 kDa-Allergens handelt, bei welchem das IgE-bindende Epitop erhalten blieb. Dies stimmt mit Ergebnissen von MAHMOUD et al. [1992]
überein, wonach für die Aktivität eines Allergens nicht die Stabilität des gesamten Proteins sondern lediglich die des Epitops von Bedeutung ist. In der Tomate zeigten sich allerdings keine Neo-Allergene, wie sie durch SCHWARZ et al. [1980] in Kuhmilch oder von POSCH et al
[1999] in Avocados nachgewiesen wurden. Durch die EAST-Inhibition konnte, entsprechend der Ergebnisse des IB, eine leichte Reduktion der allergenen Aktivität durch eine Hydrolyse mit Pepsin nachgewiesen werde. Dabei zeigten sowohl die Erhöhung der Pepsinaktivität als auch eine verlängerte Inkubationsdauer keinen Einfluß auf die allergene Potenz. YAGAMI et al.
[2000] beschrieben Allergene der Kartoffel und Kiwi, welche über eine Inkubationsdauer von 16 Stunden resistent waren. Allerdings dokumentierten sie ebenso Latexallergene, welche schon nach 8 min hydrolysiert worden sind. Die Resistenz von Pfirsichallergenen im sauren Milieu unter Einwirkung von Pepsin konnte von VAN REE et al. [2000] belegt werden.
Demgegenüber steht die Untersuchung am Apfel von JENSEN-JAROLIM et al. [1999]. Sie dokumentierten eine vollständige Hydrolyse des Hauptallergens Mal d 1 unter gastrischen Bedingungen. ASTWOOD et al. [1996] belegten ihre Aussage, daß ein Allergen die Magenpassage unter Erhaltung des Epitops überstehen muß, anhand von verschiedenen Lebensmitteln. Dabei zeigten sie, daß die Allergene eine höhere Persistenz gegenüber nicht IgE-reaktiven Proteinen aufwiesen und somit erst eine Aufnahme über die Mucosa möglich ist.
Entsprechend der nachgewiesenen Resistenz einiger Tomatenallergene wären diese demnach zu einer Sensibilisierung des Organismus befähigt. Die Sensibilisierung gegen das Profilin der Tomate scheint dagegen eher über eine Kreuzreaktion erklärbar, da schon nach einer Inkubation mit der geringsten Pepsinaktivität dieses im IB nicht mehr nachweisbar ist. Die Instabilität des Profilins wird dabei über die Ausbildung eines Konformationsepitops erklärt, welches anhand von Röntgenstrahl- und NMR-Analysen bestätigt werden konnte [CEDERGREN -ZEPPENZAUER et al. 1993,VINSON et al. 1994]. Die Wahl der Enzymaktivität für die simulierte Darmverdauung orientierte sich an der Studie von ASSELIN et al. [1989]. Die Inkubation der zuvor einer Magenverdauung unterzogenen Tomate mit Trypsin bewirkte einen Abbau der allergenen Bande bei ca. 70 kDa, wohingegen sich das Allergen bei 44 kDa als überaus resistent erwies. Daneben wurde eine neue IgE-bindende Bande oberhalb 94 kDa detektiert.
Auch die Inkubation mit Proteinase K führte zur Bildung einer neuen allergenen Bande im oberen MG-Bereich, wobei keine weiteren Banden mehr visualisiert wurden. Die Bildung dieser neuen allergenen Banden kann durch die Entstehung eines sogenannten Plasteins erklärt werden. Diese proteinähnliche Struktur wird durch die Reaktion des Hydrolates einer enzymatischen Spaltung mit proteolytischen Enzymen gebildet und weist ein höheres MG als die Ausgangssubstanz auf [ERIKSON & FAGERSON 1976]. Neben der Plastein-Reaktion kann nach ASSELIN et al. [1989] allerdings auch ein Peptid-Peptidcrosslinking für eine Neubildung von IgE-bindenden Strukturen verantwortlich sein. Die Inkubation mit Pankreatin hatte im Vergleich zum eingesetzten Extrakt der Pepsinverdauung keine weitere Hydrolyse zur Folge.
Erst eine Erhöhung der Aktivität des Pankreatins führte zum Abbau der IgE-bindenden 70 kDa Bande, während durch die Verlängerung der Inkubationsdauer keine Allergenitätsminderung erzielt werden konnte. Dies stimmt mit dem Ergebnis von MAHMOUD et al. [1992] überein, welche anhand einer Pankreatinspaltung an Molkeproteinen demonstrierten, daß in den ersten 10 % der Gesamthydrolysezeit der Hauptteil der proteolytischen Reaktion abläuft und somit auch der größte Allergenitätsverlust zu erwarten ist. Die Tomatenallergene wiesen nach der simulierten gastrointestinalen Verdauung immer noch eine recht hohe Allergenität auf, welche auf eine hohe Persistenz dieser Proteine hindeutete. Die Allergene der Erdnuß zeigen gegenüber den proteolytischen Prozessen einer simulierten Magenverdauung mit anschließender Darmverdauung eine entsprechende Persistenz [VIETHS et al. 1999]. Es kam lediglich zu einer geringen Senkung der allergenen Aktivität. Im Extrakt der verdauten Erdnuß
konnte eine IgE-bindende Bande mit einem MG von 23 kDa nachgewiesen werden, welche aus der Hydrolyse des Hauptallergens der Erdnuß (66 kDa), Ara h 1 resultierte und somit ein Fragment desselben darstellt. DOMINGUEZ et al. [1990] beschrieben eine hohe Stabilität der Senfallergene gegenüber den Verdauungsprozessen. Im Gegensatz dazu steht die Studie von BURKS et al. [1991a], in welcher von einer fast 10-fachen Reduktion der allergenen Aktivität der Sojaallergene nach erfolgtem Verdauungsprozeß berichtet wird. Ebenso zeigen die Epitope der Haselnuß [Vieths et al. 1999] und die des Ovomucoid des Hühnereies [YAMADA et al. 2000] eine geringe Persistenz gegenüber Verdauungsenzymen. Es ist jedoch auffällig, daß in vielen Lebensmitteln sowohl persistente als auch labile Allergene vorhanden sind [YAGAMI et al. 2000]. Das Auftreten von labilen Allergenen kann dabei wahrscheinlich über die existierenden Kreuzreaktivitäten zu Inhalationsallergenen erklärt werden, wodurch über den inhalativen Weg der Organismus sensibilisiert werden kann..
Die Tomatenallergie wird häufig mit dem Latex-Frucht-Syndrom in Verbindung gebracht [ABECK et al. 1994;HELBING 1997; BREHLER et al. 1997;GARCIA ORTIZ et al. 1998, RECHE et al.
2001]. Aber auch im Zusammenhang mit einer Sensibilisierung gegen Birkenpollen [HANNUKSELA & LATHI 1977;PFAU et al 1996; VIETHS et al. 1996c] sowie einer Gräserpollinose findet sie Erwähnung [ORTOLANI et al. 1988; DE MARTINO et al. 1988; BOCCAFOGLI et al.
1994]. Daneben finden sich auch vereinzelt Berichte über eine Kreuzreaktion zwischen Tomaten und Beifußpollen [WÜTHRICH et al. 1990, PICHLER & STICH 1993]. Basierend auf diesen Erkenntnissen sollte nun die Evidenz der Kreuzreaktivität zu anderen pflanzlichen Lebensmitteln untersucht werden. Für diese Studie wurden die birkenpollenassoziierten Lebensmittel Apfel, Haselnuß, Litchi und Sellerie, die latexassoziierte Banane sowie die phylogenetisch verwandte Kartoffel und Paprika ausgewählt. Das für diese Untersuchungen zusammengestellte Poolserum wies eine EAST-Klasse ≥ 2 gegen sämtliche Extrakte auf. Der Extrakt des Hühnereies diente als Kontrolle der Methode und wurde in den Untersuchungen mitgeführt. Sowohl in der phylogentisch verwandten Kartoffel als auch in der Paprika konnten sämtliche, in der Literatur beschriebenen Allergene nachgewiesen werden. Beide Extrakte vermochten bei der IB-Inhibition des elektrophoretisch getrennten Tomatenextraktes eine Inhibition sämtlicher Tomatenallergene zu induzieren. Ebenso zeigten beide Extrakte in der EAST-Inhibition, bei welcher die Tomate festphasengekoppelt vorlag, eine ähnlich hohe Allergenaktivität. Die hohe Kreuzreaktivität innerhalb der Pflanzengruppe der Solanaceae wurde über die IB- bzw. EAST-Inhibition, bei welcher der Tomatenextrakt als Inhibitor diente, bestätigt. In der IB-Inhibition wurden sämtliche Allergene der Kartoffel eliminiert oder zumindest stark geschwächt, während die Paprikaallergene komplett gehemmt wurden.
Ebenso waren die jeweils erreichten C50-Werte der homologen Inhibitionen und der des Tomatenextraktes annährend identisch. ORTEGA et al. [1999] untersuchten die Kreuzreaktivität der Pflanzengruppe der Solanaceae anhand des Tabaks. Dabei stellten sie mittels CAP-Inhibition und des Skin Prick Tests fest, daß die Tomatenallergene Homologien zu den Tabakallergenen aufweisen. Allerdings konnte zwischen dem Tabak und der Kartoffel trotz botanischer Verwandtschaft keine Kreuzreaktivität nachgewiesen werden. RECHE et al. [2001]
dokumentierten mittels IB- und CAP-Inhibition eine sehr hohe Kreuzreaktivität zwischen der Kartoffel und der Tomate, welche sie unter anderem auf das zum Latexallergen Hev b 7 homologen Patatin mit einem MG von 44-46 kDa zurückführen. Auch HELBING [1997]
vermutet, daß das Speicherprotein Patatin mit einem MG von 46 kDa eine wichtige kreuzreaktive Struktur beim Latex-Frucht Syndrom darstellt. Im Vergleich zu den botanisch
verwandten Lebensmitteln zeigte die latexassoziierte Banane eine schwächere immunologische Beziehung zu den Tomatenallergenen. In der IB-Inhibition vermochte der Extrakt der Banane die Tomatenallergene bei 44 und 65 kDa nicht vollständig zu inhibieren. Andersherum konnte die IgE-Bindung an das 43 kDa- Bananenallergen durch den Tomatenextrakt ebenfalls nicht komplett gehemmt werden. Entsprechend dazu lag der C50-Wert der homologen EAST-Inhibition der Tomate bei einer Konzentration von 1.7 µg/mL, wohingegen eine Konzentration von 86.5 µg/mL des Bananenextraktes für eine 50 %ige Inhibition nötig waren. Die EAST-Inhibition des festphasengekoppelten Bananenextraktes lieferte ähnliche Ergebnisse. Eine Kreuzreaktivität zwischen der Banane und der Tomate gilt damit als bestätigt, die wohl haupsächlich auf die Strukturhomologie der Bananenallergene zum Latexallergen Hev b 7 zurückzuführen ist [BLANCO et al. 1994; ANDRE et al. 1995]. Bei der Charakterisierung der Allergene der birkenpollenassoziierten Lebensmittel Apfel, Haselnuß, Litchi und Sellerie konnten nicht alle in der Literatur beschriebenen Allergene detektiert werden. Während im Apfel sämtliche Allergene, unter anderem auch das Mal d 1, visualisiert wurden, wies das Poolserum keine spezifisches IgE gegen das Hauptallergen der Haselnuß bei 18 kDa, dem 16 kDa Allergen der Litchi sowie den Hauptallergenen Api g 1 und Api g 2 des Selleries mit MG von 16 bzw. 17 kDa auf. Während die Inkubation des Sellerieextraktes in der IB-Inhibition zu einer Schwächung aller IgE-bindenden Banden führte, war nach erfolgter Inkubation des Apfelextraktes noch eine deutliche Bande bei 65 kDa apparent. Durch die Litchi konnten die allergenen Banden bei MG von 26, 36 und 44 kDa nicht inhibiert werden. Die Inkubation mit dem Haselnußextrakt resultierte lediglich in der Inhibition des Tomatenprofilins. Alle anderen Banden waren weiterhin vorhanden. Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in der EAST-Inhibition der festphasengekoppelten Tomate wider. Von den vier Extrakten besaß, entsprechend der IB-Inhibition, der Sellerieextrakt die höchste und der Haselnußextrakt die geringste Inhibitionsfähigkeit. Bei der Litchi bzw. der Sellerie als Festphasenkomponenten wurde jeweils eine allergene Bande bei 50 kDa durch die Tomate nicht inhibiert. Des weiteren zeigte das 23 kDa Allergen der Sellerie keine Kreuzreaktivität zu den Tomatenallergenen. In der EAST-Inhibition wiesen sowohl die Litchi als auch der Sellerie im Vergleich zur Tomate dagegen ähnliche C50-Werte auf. Im Gegensatz dazu kam es durch die Tomate nur zu einer geringfügigen Inhibition des Apfels und der Haselnuß. Das Hauptallergen des Apfels, Mal d 1, zeigte in der IB-Inhibition keine immunologischen Ähnlichkeiten zu den Tomatenallergenen und konnte somit nicht durch diese inhibiert werden. Zudem bewirkte der Tomatenextrakt in der EAST-Inhibition lediglich eine maximale Inhibition von 26 %. Ähnliche Ergebnisse wurden anhand der Haselnuß erzielt. In der IB-Inhibition wurde keine Eliminierung der allergenen Bande bei 18 kDa durch die Tomate erreicht. Ebenso lag der C50-Wert, resultierend aus der EAST-Inhibition des Tomatenextraktes mit 173.5 µg/mL signifikant höher als der der homologen Inhibition mit dem Haselnußextrakt (0.9 µg/mL). Basierend auf diesen Ergebnissen kann nur von einer geringfügigen Kreuzreaktivität der Tomate zum Apfel und der Haselnuß ausgegangen werde. Da die jeweiligen Hauptallergene des Apfels bzw. der Haselnuß stark homolog zum Bet v 1 sind, wird vermutet, daß die Tomatenallergene keine immunologische Übereinstimmung mit diesem Birkenpollenallergen aufweisen. Diese Vermutung wird durch die Studie von FÖTISCH et al. [2001] gestützt, in welcher nur eine unwesentliche Inhibition der Tomatenallergenität durch rekombinates Bet v 1 erzielt werden konnte. Es ist daher zu vermuten, daß die in der Literatur beschriebene Kreuzreaktivität zu Birkenpollen in erster Linie auf Bet v 2 Homologe der Tomate und auf CCD zurückzuführen ist. Wie am Beispiel der Litchi