Differenzierung und Reifung der mit siRNA-behandelten Zellen in der Flüssigkultur Flüssigkultur

Tabelle 6.12: Hemmung der Expression von CLCN3 und TAL1 durch siRNA Transfektion an Kulturtagen 10 und 14. Die Mock-Kontrolle wurde hier als Bezugsgröße gesetzt (n=2).  

6.4.1 Differenzierung und Reifung der mit siRNA-behandelten Zellen in der Flüssigkultur

Die Oberflächenexpression von GPA, CD36, CD71 und CD45 der transfizierten erythropoetischen Zellen wurden durchflusszytometrisch 20 bzw. 72 Stunden nach der Transfektion untersucht, um ihre Differenzierung zu kontrollieren. Der letzte Zeitpunkt der Untersuchung hier war 96 Stunden nach der letzten Transfektion. Zusätzlich wurden Zytospinpräparate hergestellt und Pappenheim bzw. Neutral-Benzidin gefärbt und bei 1000-facher Vergrößerung mikroskopisch untersucht (siehe 5.4 und 5.5). Die Hochregulierung von GPA, die Herunteregulierung von CD45 und die Expression von CD36 und CD71 zeigten, dass auch die transfizierten Zellen alle Differenzierungsstadien einer Standard-Erythropoesekultur durchlaufen. Die GPA-Expression 96h nach Transfektion betrug in den CLCN3-transfizierten Zellen 51,5 ± 14,1%, in den TAL1-transfizierten Zellen 61,2 ± 11,9% und in der Mock-Kontrolle 75,6 ± 7,4%. Im Vergleich dazu stieg die GPA-Expression in den nicht-transfizierten Zellen in der Standard-Kultur zum diesem Zeitpunkt auf 88,0 ± 5,5%. Parallel dazu sank die Expression des CD45 Antigens am letzten Untersuchungstag (Tag 14, 96 h nach Transfektion) in allen Kulturen mit 55,6 ± 10,6 bei CLCN3-transfizierten Zellen, 39,9 ± 2,8% bei TAL1-transfizierten Zellen und 23,4 ± 14% bei der Mock-Kontrolle. Insgesamt zeigten die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchungen, dass auch die transfizierten Zellen die gleiche erythropoetische Zellreifung durchlaufen, wenn auch nicht im gleichen Maße, wie die Standard-Erythropoese (Abbildung 6.27 und 6.28). Auch die Zytospinergebnisse der transfizierten Kulturen bestätigten die Ergebnisse der Durchflusszytometrie im Sinne der Entwicklung der Zellen zu erythrozytären Zellen. Allerdings wurden sowohl in CLCN-transfizierten Kulturen als auch in TAL1-CLCN-transfizierten Kulturen kaum Retikulozyten

CLCN3 [%] TAL1 [ %]

Ergebnisse  

beobachtet (TAL-transfizierte Kultur 1± 2,8%, CLCN3-transfizierte Zellen 0% am Tag 14 und 72 h nach der Transfektion). Gleichzeitig waren bei Tal1 transfizierten Zellen 39 ± 7,1% und bei CLCN-transfizierten Zellen 55,5 ± 20,5% Zellen aus der weißen Zellreihe beobachtet werden (Abbildungen 6.29-6.31).

Ergebnisse

Abbildung 6.27: Oberflächenexpression nach Transfektion in Flüssigkultur im Vergleich zu Standard-Erythropoese und zur Mock-Kontrolle: Die Abbildung zeigt den Verlauf der Expression von erythropoetischen Markern GPA und CD45 auf erythropoetischen Zellen nach einer siRNA-Transfektion gegen die Gene TAL1 und CLCN3, 20 bzw. 72 Stunden nach der Transfektion. Der größte Unterschied konnte in der GPA-Expression zwischen der Standard Kultur und den transfizierten Kulturen beobachtet werden (n=2) (d=Tag; h=Stunden nach Transfektion).

C

Ergebnisse  

  D

Abbildung 6.29: Oberflächenexpression nach Transfektion in Flüssigkultur im Vergleich zu Standard-Erythropoese und zur Mock-Kontrolle: Die Abbildung zeigt den Verlauf der Expression von erythropoetischem Marker CD36 und CD71 auf erythropoetischen Zellen nach einer siRNA-Transfektion gegen die Gene TAL1 und CLCN3, 20 bzw. 72 Stunden nach der Transfektion. Der größte Unterschied konnte in der GPA-Expression zwischen der Standard Kultur und den transfizierten Kulturen beobachtet werden (n=2) (d=Tag; h=Stunden nach Transfektion).  

0

Ergebnisse

Abbildung 6.30: Vergleich der Zytospinpräparate der Transfektionsversuche mit siRNA gegen CLCN3 (A) und TAL1 (B). Proben aus der siRNA-transfizierten Zellen gegen die Gene TAL1 und CLCN3 bzw.

Mock-Kontrolle wurden jeweils 20 bzw. 72 Stunden nach der Transfektion entnommen und Pappenheim bzw. Neutral-Benzidin gefärbt. Aufgetragen sind die prozentualen Anteile an verschiedenen Zelltypen gegen Untersuchungstage der Kultur (n=2). (andere = Zellen der weißen Reihe; Basophile E .= Basophile Erythroblasten; Polychromatische E. = Polychromatische Erythroblasten).

0%  

Ergebnisse  

Abbildung 6.21: Vergleich der Zytospinpräparate der Transfektionsversuche der Mock-Kontrolle. Proben aus der siRNA-transfizierten Zellen gegen die Gene TAL1 und CLCN3 bzw. Mock-Kontrolle wurden jeweils 20 bzw. 72 Stunden nach der Transfektion entnommen und Pappenheim bzw. Neutral-Benzidin gefärbt.

Aufgetragen sind die prozentualen Anteile an verschiedenen Zelltypen. (n=2). (andere = Zellen der weißen Reihe; Basophile E.= Basophile Erythroblasten; Polychromatische E. = Polychromatische Erythroblasten).

72 Stunden nach der Tranfektion am Transefktionstag 10 und zeigten alle drei Kulturen die ersten Hämoglobin-bildenden Zellen. Die Gesamtanzahl der erythropoetischen Zellen nahm in allen transfizierten Kulturen mit der Kultivierungszeit zu und erreichte zu dem Ende der Kultur und trotz dreimaliger Transfektion einen Wert von 42,5 ± 4,8% bei CLCN3-Transfektion und 60 ± 3,1% bei TAL1-Transfektion. Die Mock-Kontrolle bestand zum selben Zeitpunkt zu 79,5± 7,1% aus erythrozytären Zellen. Der Anteil an Retikulozyten am letzten Kulturtag betrug bei den TAL-transfizierten Zellen 1 ± 0,4%. Bei der CLCN3 Hemmung konnten keine Retikulozyten 72 Stunden nach der Transfektion beobachtet werden. Die Mock-Kontrolle bestand zu diesem Zeitpunkt zu 19,5± 10,6 aus Retikulozyten. Der Hauptunterschied zwischen TAL1- und CLCN3-transfizierten Kulturen bestand im Anteil an polychromatischen Zellen. Während TAL1-transfizierten Kulturen 28

± 9,9% polychromatische Zellen hervorbrachten, betrug der Anteil dieser Zellen bei den CLCN3-transfizierten Kulturen 14,5 ± 2,1%. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Herunterregulierung davon TAL1 und CLCN3 die Erythropoese beeinträchtigt wird.

0%  

Ergebnisse  

CLCN3 D7 nach 20h

D10 nach 20 h D10 nach 72h

D14 nach 20h D14 nach 72h

Abbildung 6.30: Zytospinpräparate der gegen CLCN3 siRNA-transfizierten Zellen. Die Zellen wurden 20 bzw. 72 Stunden nach Transfektion Neutral-Benzidin gefärbt. 72 Stunden nach Transfektion am Tag 14 kann zwar eine Hämoglobinproduktion aber keine Retikulozytengenerrierung beobachtet werden.

Ergebnisse  

Mock-Kontrolle D7 nach 20h

D10 nach 20 h D10 nach 72h

D14 nach 20h D14 nach 72h

Abbildung 6.31: Zytospinpräparate der Mock siRNA-transfizierten Zellen. Die Zellen wurden an 20bzw. 72 Stunden nach Transfektion Neutral-Benzidin gefärbt. 72 Stunden nach der Transfektion am Tag 14 der Kultur konnten Normoblasten und Retikulozyten in der Kultur beobachtet werden. Der schwarze Pfeil zeigt einen Retikulozyten und der rote Pfeil einen Normblasten.

Ergebnisse  

TAL1 D7 nach 20h

D10 nach 20 h D10 nach 72h

D14 nach 20h D14 nach 72h

Abbildung 6.32: Zytospinpräparate der TAL1 siRNA-transfizierten Zellen. Die Zellen wurden an 20bzw. 72 Stunden nach Transfektion Neutral-Benzidin gefärbt. 72 Stunden nach der Transfektion am Tag 14 kann zwar eine Hämoglobinproduktion aber keine Retikulozytengenerierung beobachtet werden.

Diskussion

7. Diskussion

Der Prozess der Differenzierung von Erythrozyten ist komplex und besteht aus mehreren Schritten. Er beginnt mit der Differenzierung der Stammzellen zu frühen erythropoetischen Vorläuferzellen (burst-forming units-erythroid, BFU-E), dann zu späten erythropoetischen Vorläuferzellen (colony-forming unit-erythroid, CFU-E). Die Erythrozyten der Mammalia sind einzigartig im Vertebratenreich, da sie ihren Kern ausschleusen und eine dramatische Formveränderung durchlaufen, um als ausgereifte und funktionell einsatzfähige Zellen in den Blutkreislauf zu gelangen. Dabei nimmt das Zellvolumen ab, die Nukleoli werden kleiner, bis sie nicht mehr sichtbar sind, das Kernchromatin wird dichter und der Zellkern pyknotisch. Schließlich wird dieser ausgestoßen. Der reife Erythrozyt nimmt eine bikonkave Form an und besitzt keine Actinfilamente und Microtubuli mehr. Frühere morphologische Studien haben gezeigt, dass der Enukleationsprozess Ähnlichkeiten zu dem der Zytokinese aufweist, insofern als dass sich eine Zytoplasmaabschnürung, ähnlich einer Teilungsfurche zwischen dem auszuschleusenden Kern und dem zukünftigen Retikulozyt bildet [66, 67, 108-110]. Skutelsky und Danon [110] haben gezeigt, dass der Mikrotubulus wichtig für die richtige Positionierung der Abschnürung zwischen dem Retikulozyten und dem Kern ist. Die Gruppe um Rouzbeh et al. Identifizierte verschieden miRNAs, die eine potenzielle Rolle in der erythropoetischen Enukleation spielen [161].

Eine andere Studie [111] zeigte anhand von Versuchen an murinen Milzerythroblasten, die für eine kurze Zeit in vitro kultiviert wurden, dass Cytochalasin B die Enukleation inhibieren kann. Dieses Ergebnis diente als Hinweis für die Bedeutung von Filament-Actin (F-Actin). Durch Inkubation von FVA-Zellen (Friends virus anemia cells) mit Cytochalasin B konnte in einer weiteren Studie eine reversible Inhibierung der Enukleation erreicht werden, welche als Hinweis für die Bedeutung von F-Actin und somit auch als Beweis der Ähnlichkeit der Enukleation zur Zytokinese diente [40]. Allerdings wurden keine Veränderungen der Actinfilamente vor der Enukleation gezeigt, auch wurde kein Actin in enukleierenden Zellen nachgewiesen und die Rolle von anderen Zytoskelett-Elementen bisher nicht genau untersucht. Die Mechanismen der Enukleation sind also noch nicht vollkommen bekannt. In diesem Zusammenhang ist die Aufklärung der Genexpression während des Enukleationsvorgangs und die Identifizierung von differentiell regulierten Genen hilfreich.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei bereits veröffentlichte Erythropoesekulturen [49, 50] miteinander in ihrer Proliferations- und Differenzierungskapazität – unter anderem in Kokultivierung mit MSCs (n Stammzellen) –verglichen [146]. Dabei zeigte die Kultur

Diskussion

nach Panzenböck eine bessere Reifung der Zellen und brachte einen höheren Anteil an Retikulozyten hervor, während die Kultur nach Neildez-Nguyen eine höhere Proliferation zeigte. Nach einer Microarrayanalyse der Erythropoesekultur nach Neildez-Nguyen wurden die Gene TAL1 und CLCN3 für eine funktionelle Studie ausgesucht, da diese einen konstanten Anstieg der Expression im Verlauf der Kultur zeigten. Zudem ist TAL1 ein wichtiger Faktor für die erythropoetischen Zellreifung [156]. Durch die siRNA Transfektion gegen diese zwei Gene konnte eine Herabsetzung der Zellreifung in der Erythropoesekultur beobachtet werden, wie anhand der Zytopsin- und durchflußzytometrieergebnisse gezeigt werden konnte. In den tranfizierten Kulturen waren kaum Normoblasten und so gut wie keine enukleierten Retikulozyten zu sehen.