3.3 Der Einfluss von ATP auf die Translokation von GBP über die PVM
3.3.2 Die Translokation von GBP über die PVM ist von der Hydrolyse des vorhandenen ATP
Da aus dem vorangegangenen Experiment deutlich hervorgeht, dass das Vorhandensein von ATP im Zytosol von nicht-infizierten Erythrozyten essentielle Voraussetzung für die Translokation von GBP über die PVM ist, sollte in dem folgenden Experiment untersucht werden, inwiefern die Hydrolyse von ATP erforderlich ist, um die Translokation zu vermitteln. Daher wurde der Einfluss vom ATP-Analogon AMP-PNP getestet, welches gleiche Bindungseigenschaften wie ATP besitzt, sich allerdings durch eine nicht-hydrolysierbare Phosphat-Gruppe auszeichnet.
Zunächst wurden 3x108 iRBC mit 4 HE SLO permeabilisiert und für die Chase-Phase im Translokationsassay vorbereitet. Die Zellen wurden auf drei Ansätze à 1x108
inkubiert. Der dritte Ansatz wurde in RBCC unter Zugabe von 5 mM AMP-PNP inkubiert. Nach Ende der Chase-Phase und dem Erhalt der einzelnen Fraktionen wurden die Proteingemische mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Verteilung der Proteine GBP, SERP und ALD durch Western-Blotting visualisiert. Die Bandenintensitäten des Proteins GBP in den Pellet- und Überstand-Fraktionen wurden quantifiziert und statistisch ausgewertet.
5 mM AMP-PNP P S P S P S
120 100
120 50 40 kDa
GBP
SERP ALD
-RPMI
-RBCC
+
A
RBCC1 2 3 4 5 6
5 mM AMP-PNP P S P S P S
120 100
120 50 40 kDa
GBP
SERP ALD
-RPMI
-RBCC
+
A
RBCC1 2 3 4 5 6
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC
+ 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
P S
B
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC
+ 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
P S
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC
+ 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
P S P P S S
B
Abb. 3.8: Einfluss von AMP-PNP im RBCC auf die Translokationseffizienz von GBP.
Für den Einsatz im Translokationsassay wurden Trophozoiten-infizierte Erythrozyten mit 4 HE SLO permeabilisiert, für 45 min in RPMI inkubiert und die Zellen anschließend in RPMI, RBCC oder RBCC mit 5 mM AMP-PNP für weitere 30 min inkubiert. (A) Western-Blot (WB) zur Visualisierung der Verteilung von GBP (7,5 %iges SDS-Gel), SERP und ALD (10 %iges SDS-Gel). Auftrag pro Spur: 1x10(7) Zelläquivalent; 1. Ak Kaninchen-α-GBP, Kaninchen-α-SERP, Kaninchen-α-ALD; 2. Ak Ziege-α-Kaninchen (HRP). (B) Verteilung von GBP in den analysierten Fraktionen nach Quantifizierung der Bandenintensitäten. Für jeden einzelnen im Translokationsassay analysierten Ansatz wurden die Werte der Bandenintensitäten aus Pelletfraktion und Inkubationsüberstand addiert und dem Wert 100 % gleichgesetzt. Anschließend wurden damit die prozentualen Werte der einzelnen Fraktionen und die Standardabweichung aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten ermittelt. Abk.: P (Pellet = lösliche Proteine aus Parasit und parasitophore Vakuole), S (Supernatant = lösliche Proteine aus Inkubationsüberstand).
Die Abbildung 3.8 A zeigt eine repräsentative Western-Blot Analyse von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Die statistische Auswertung der Verteilung von GBP in Abb. 3.8 B verdeutlicht die Arretierung der Translokation in Anwesenheit von RPMI durch die Detektion von durchschnittlich 3 % der gesamten Bandenintensität von GBP im Inkubationsüberstand. Auch der positive Richtwert, repräsentiert durch die Inkubation in RBCC, zeigt eine erwartet hohe Translokationseffizienz. Die Zugabe von 5 mM AMP-PNP zum RBCC hat einen sichtbaren negativen Einfluss auf die Translokationseffizienz und führt zu einer Reduktion der GBP-Bandenintensität um ca. 20 % im Vergleich zum positiven Richtwert.
In einem weiteren Ansatz sollte überprüft werden, ob extern zugeführtes ATP und AMP-PNP in direkter Konkurrenz zu einer freien Bindungsstelle eines ATP-hydrolysierenden Proteins stehen, welches an der Translokation von GBP über die PVM beteiligt ist. Dafür wurden 6x108 iRBC mit 4 HE SLO permeabilisiert, gewaschen und für den Translokationsassay vorbereitet. Die Zellen wurden auf sechs Ansätze à 1x108 iRBC aliquotiert und neben den Kontrollen in Apyrase-behandeltem RBCC unter Zusatz von 5 mM ATP, 5 mM AMP-PNP oder beidem für den Chase inkubiert. Nach Erhalt der einzelnen Fraktionen der jeweiligen Ansätze wurden die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Verteilung der Markerproteine SERP und ALD sowie GBP durch Western-Blotting visualisiert und ausgewertet.
Die Abbildung 3.9 zeigt einen repräsentativen Western-Blot und die statistische Auswertung von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Die in RPMI inkubierten Zellen zeigen in Spur 2 die erwartete geringe Bandenintensität von durchschnittlich 7 %, während die Inkubation der Zellen in RBCC in Spur 4 zur Detektion von ca. 50 % der Gesamintensität des Proteins GBP im Inkubationsüberstand geführt hat. Auch die Depletion von ATP durch eine dem Chase vorhergehende Behandlung des RBCC mit Apyrase hat zu der erwarteten Arretierung der Translokationsaktivität geführt, so dass nur ca. 4% der Bandenintensität in Spur 6 gemessen wurden. Die Zugabe von 5 mM ATP zu dem Apyrase-behandelten RBCC konnte die rekonstitutiven Eigenschaften des RBCC wieder herstellen, was durch die Detektion von GBP in Spur 8 im Inkubationsüberstand deutlich dokumentiert ist.
Die Zugabe von 5 mM AMP-PNP zu Apyrase-behandeltem RBCC hatte keinen positiven Einfluss auf die Translokationseffizienz, so dass die Transportrate dem des Apyrase-Ansatzes ähnlich ist. Die Zugabe von sowohl ATP als auch AMP-PNP in gleichen Konzentrationen zum ATP-depletierten RBCC führte zu einem intermediären Effekt auf die Translokationsaktivität. Die Detektion von
Abb. 3.9: Einfluss von ATP und AMP-PNP in Apyrase-behandeltem RBCC auf die Translokationseffizienz von GBP. Für den Einsatz im Translokationsassay wurde RBCC zunächst mit 1 U/ml Apyrase für 1 h bei 37 °C inkubiert. Währenddessen wurden Trophozoiten-infizierte Erythrozyten mit 4 HE SLO permeabilisiert, für 45 min in RPMI inkubiert und die Zellen anschließend in RPMI, RBCC oder Apyrase-behandeltem RBCC mit 5 mM ATP bzw AMP-PNP in den angegebenen Kombinationen für weitere 30 min inkubiert. (A) Western-Blot (WB) zur Visualisierung der Verteilung von GBP (7,5 %iges SDS-Gel), SERP und ALD (10 %iges SDS-Gel). Auftrag pro Spur: 1x10(7) Zelläquivalent; 1. Ak Kaninchen-α-GBP, Kaninchen-α-SERP, Kaninchen-α-ALD; 2. Ak Ziege-α-Kaninchen (HRP). (B) Verteilung von GBP in den analysierten Fraktionen nach Quantifizierung der Bandenintensitäten. Für jeden einzelnen im Translokationsassay analysierten Ansatz wurden die Werte der Bandenintensitäten aus Pelletfraktion und Inkubationsüberstand addiert und dem Wert 100
% gleichgesetzt. Anschließend wurden damit die prozentualen Werte der einzelnen Fraktionen und die Standardabweichung aus zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten ermittelt. Abk.:
P (Pellet = lösliche Proteine aus Parasit und parasitophore Vakuole), S (Supernatant = lösliche Proteine aus Inkubationsüberstand).
P S P S P S P S P S P S
120 100
120 50 40 kDa
GBP SERP ALD
-RPMI
-RBCC
+ -RBCC
+ + -RBCC
+ -+ RBCC
+ + + RBCC
1U/ml Apyrase 5 mM ATP 5 mM AMP-PNP
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P S P S P S P S P S P S
120 100
120 50 40 kDa
GBP SERP ALD
-RPMI
-RBCC
+ -RBCC
+ + -RBCC
+ -+ RBCC
+ + + RBCC
1U/ml Apyrase 5 mM ATP 5 mM AMP-PNP
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC +
-RBCC + +
-1 U/ml Apyrase 5 mM ATP 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
RBCC +
-+
RBCC + + +
P S
B
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC +
-RBCC + +
-1 U/ml Apyrase 5 mM ATP 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
RBCC +
-+
RBCC + + +
P S
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC +
-RBCC + +
-1 U/ml Apyrase 5 mM ATP 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
RBCC +
-+
RBCC + + + 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
RPMI
-RBCC
-RBCC +
-RBCC + +
-1 U/ml Apyrase 5 mM ATP 5 mM AMP-PNP
Verteilung von GBP / %
RBCC +
-+
RBCC + + +
P S P P S S
B
durchschnittlich 31 % der Gesamtintensität der GBP-Banden dieses Ansatzes im Inkubationsüberstand (Spur 12) deutet darauf hin, dass die Anwesenheit von AMP-PNP die Eigenschaften des ATP zur Wiederherstellung der Translokationsaktivität von RBCC negativ beeinflusst. Dies liegt vermutlich an dem Umstand, dass durch die Verwendung gleicher Konzentrationen von ATP und AMP-PNP die Wahrscheinlichkeit für ATP, von einem an der Translokation beteiligten Protein gebunden und hydrolysiert zu werden, theoretisch um die Hälfte reduziert ist.