Die Testsysteme

Für Zytotoxizitäts- oder Proliferationsuntersuchungen an Zellen in Kulturen ist ein direktes Zählen der Zellen mit Hilfe eines Mikroskops oder mit einem elektronischen Zellzähler nicht immer geeignet. Deshalb wurden diese Methoden häufig durch indirekte Methoden ersetzt.

Dabei werden bestimmte Komponenten der Zellen, wie DNA- und Proteingehalt, die Aktivität bestimmter Enzyme, die zelluläre Aufnahme von Farbstoffen oder fluoreszierenden Stoffen oder auch die Radioaktivität von Zellen nach Einbau eines Nukleotid-“labels“, bestimmt. Es werden also Parameter charakterisiert, die auch Indikatoren für überlebensnotwendige Zellfunktionen sind. Dazu gehören Zellteilung und Wachstum, Proteinsynthese und Proteingehalt, Anhaftungs-und Ablöseverhalten, Sauerstoffverbrauch, Membranintegrität Anhaftungs-und Energieverbrauch.

Die Testsysteme können in zwei Hauptklassen unterteilt werde: die Schnelltests oder auch Kurzzeittests, bei denen die Membranpermeabilität oder eine Stoffwechselveränderung bestimmt wird, und die Langzeittests, bei denen die Überlebensrate oder der Erhalt der Reproduktionskapazität von Zellen über Zellzahl, Proteingehalt oder DNA-Gehalt bestimmt wird.

Effekte auf den Stoffwechsel oder die Vitalität einer Zelle können reversibel sein. Um einen irreversiblen Effekt auf die Überlebensfähigkeit der Zellen nachzuweisen, müssen die Kulturen nach der Inkubation mit der entsprechenden Substanz in Abwesenheit der Substanz weiter kultiviert werden. Dies kann z.B. mit dem Test auf Plattiereffizienz quantifiziert werden, bei dem Zellen 24h mit der Substanz inkubiert und dann trypsiniert werden. Nach mehreren Tagen können dann die gebildeten Zellkolonien ausgezählt werden [34].

4.1.1.1 Der LDH Test

Der Zelltod wird häufig über die Quantifizierung der Membranschädigung bestimmt. Oft werden die Aufnahme oder die Exklusion von Farbstoffen, wie z.B. Trypanblau oder Ethidiumbromid, genutzt oder das Abgeben von radioaktiven Isotopen z.B. [³H]-Prolin oder -Thymidin. Die dritte Möglichkeit ist das Bestimmen von zytosolischen Enzymen im Kulturmedium, die aus geschädigten Zellen diffundieren können, wobei die Enzymaktivität direkt proportional zur Zahl der lysierten Zellen ist. Die Laktatdehydrogenase (LDH) ist ein stabiles, im Zytoplasma aller

Zellen vorkommendes Enzym, das bei Zellschädigung schnell in das Kulturmedium abgegeben wird. Die Enzymaktivität der LDH wurde mit Hilfe des Cytotoxicity Detection Kits von Boehringer Mannheim bestimmt.

Im ersten Schritt wird Laktat durch die freigesetzte Laktatdehydrogenase zu Pyruvat oxidiert, während NAD⁺ zu NADH+H⁺ reduziert wird. In der zweiten enzymatischen Reaktion werden zwei Wasserstoffatome von NADH+H⁺ auf das gelbe Tetrazoliumsalz INT (2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid) transferiert und es entsteht das rote Formazan Salz.

Hierbei wird Diaphorase als Katalysator eingesetzt.

Da für den Test nur 0,2-2x10⁴ Zellen notwendig sind, kann er arbeitserleichternd in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Da fetales Kälberserum auch LDH enthält, ist es unbedingt notwendig immer eine Mediumblindprobe mitzuführen. Auch die getesteten Substanzen können einen Einfluß auf die LDH- oder die Diaphorase-Aktivität haben und sie beispielsweise hemmen, weshalb auch hier das Mitführen einer zusätzlichen Kontrolle erforderlich ist. Des weiteren wurde die LDH-Aktivität in unbehandelten Kulturen und in mit 1%

Triton X 100 behandelten Kulturen überprüft, um die minimale, spontane und die maximal mögliche LDH-Freisetzung der Zellen zu bestimmen.

Das Prinzip der Bestimmung der LDH-Aktivität ist in Abbildung 4-1 dargestellt.

C

-Abbildung 4-1: Bestimmung der LDH

4.1.1.2 Bestimmung des DNA-Gehalts mit bisBenzimid

Neben der Zellzahl sind die Bestimmung von DNA- und Proteingehalt die gebräuchlichsten Meßwerte bei der Quantifizierung von zellulärem Material. Die DNA kann durch ihre Absorption bei 260nm bestimmt werden, wobei aber viele Zellbestandteile, z.B. Proteine stören. Deshalb ist diese Methode nur für gereinigte DNA geeignet. Bisbenzimid (Hoechst 33258, 2’-4[Hydroxyphenyl]-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5’-bis-1H-benzimidazol) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der sich selektiv in Adenin/ Thymin-reichen Regionen der DNA anlagert. Es findet dabei jedoch keine Interkalation in die Doppelhelix statt. Die Quantifizierung des DNA-Gehalts von Zellen mit bisBenzimid beruht auf der Zunahme der Fuoreszenzemission von bisBenzimid bei 458nm infolge der Wechselwirkung des Farbstoffs mit der DNA. Dies wird bei pH 7,4 und bei hoher Salzkonzentration, bei der das Chromatinprotein dissoziiert, durchgeführt.

Vorher ist ein Zellaufschluß durch Behandlung mit Ultraschall oder durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Kulturen notwendig. Diese Methode gestattet einen Nachweis von 10ng/ml und erfordert eine doppelsträngige DNA [56].

Bei der Bestimmung des DNA-Gehalts wird die DNA von allen Zellen bestimmt, die adherent sind. Geschädigte oder tote Zellen, die sich nicht vom Substrat gelöst haben werden mitbestimmt. Der DNA-Gehalt in einer Zelle ist annähernd konstant, weshalb durch Bestimmung des DNA-Gehalts direkt auf die Zellzahl geschlossen werden kann. Im Hinblick auf das Proliferationsverhalten von Hep G2-Zellen, dargestellt in Abbildung 2-3, wurde ein DNA-Gehalt von 85% nach einer Inkubation mit einer Substanz über 24h so bewertet, daß kein Wachstum stattgefunden hat. Prozentzahlen darunter weisen auf Zelltod hin. Bei Werten zwischen 85% und 100% hatte zwar Wachstum stattgefunden, dieses wurde aber gehemmt. Für Inkubationszeiten von 72h lag dieser Grenzwert bei 65%.

4.1.1.3 Bestimmung des Proteingehalts mit Amidoschwarz

Das Anfärben von Zellproteinen mit Amidoschwarz 10B kann für Tests der Proliferation, der Zytotoxizität, für die Bestimmung adherenter Zellen und zur Quantifizierung der Zellzahl herangezogen werden. Doch ist das Verhältnis von Proteingehalt zu DNA-Gehalt nur unter standardisierten Bedingungen in einer Zelle bzw. in einer Zellkultur konstant. Ansonsten können Proteingehalt bzw. RNA-Gehalt einer Zelle beträchtlichen Schwankungen unterworfen sein, weshalb die Nutzung der Proteinbestimmung zur Quantifizierung der Zellzahl fraglich ist.

Zur Bestimmung des Proteingehalts mittels Amidoschwarz 10B werden die Zellen mit Formaldehyd fixiert, nicht adherente Zellen entfernt und die adherenten Zellen mit Amidoschwarz bei saurem pH inkubiert. Dabei bindet der Farbstoff an den Amidostickstoff des Proteins.

Proteingebundener Farbstoff kann danach vollständig mit NaOH eluiert werden und mit Hilfe

eines Mikrotiterplatten-Photometers photometrisch vermessen werden. Eine Linearität zwischen Zellzahl und Absorption war in einem Bereich von 1000-64000 Zellen pro well gewährleistet, was bei der Validierung dieses Tests mit Hilfe von HaCaT-Zellen festgestellt wurde [91].

Das Anfärben von Zellproteinen ermöglicht eine Detektion sowohl von zytostatischen als auch zytolytischen Effekten toxischer Substanzen, wenn die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellinie bekannt ist. Eine Unterscheidung zwischen vitalen und toten Zellen ist nicht möglich. Da aber bei adherent wachsenden Zellen sich unter den meisten Kulturbedingungen tote Zellen vom Substrat lösen, kann davon ausgegangen werden, daß die bestimmten Proteine von lebenden Zellen stammen. Zellen die also geschädigt oder schon tot sind und sich nicht vom Substrat gelöst haben, werden bei dem Amidoschwarz-Assay mitbestimmt [91].

N N

N N

NO2

OH

SO3Na NaSO3

NH2

Abbildung 4-2: Amidoschwarz 10B