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114 zeigten Studien mit Ferredoxinen, dass die Stabilität des [4Fe-4S]-Cluster erhöht ist, wenn die Cluster-Liganden bzw. die Cysteinreste von hydrophoben Aminosäuren benachbart sind (Mulholland et al., 1999). Das Cystein an Position 39 in FLP, welches einen veränderten Abstand zu den anderen Cysteinen der Sensordomäne aufweist, wird im Vergleich zu FNRE. coli überraschenderweise von nur hydrophoben AS benachbart. Es befinden sich Alanine an Position 37, 40 und 41 sowie ein Isoleucin an Position 38. Dies ist ein Indiz für eine höhere Stabilität von FLPXcv bzw. dessen [4Fe-4S]-Clusters gegenüber Sauerstoff im Gegensatz zu FNRE. coli.
Anhand der aufgeführten Ergebnisse lässt sich ein komplexes Zusammenspiel der Aconitasen und des FLP-Proteins in Xcv bei der Regulation der Gene der Cytochrome-d-Ubiquniol-Oxidase und der Cytochrome-aa3-Ubiquinoloxidase vermuten. Vor allem AcnA2 scheint neben AcnB eine sensorische und überraschend große und weitläufige regulatorische Rolle einzunehmen und eventuell eine unterstützende Funktion auf die Aktivierung der Expression von cydABX auszuüben. Es ist denkbar, dass gerade im Apoplasten von Paprikapflanzen eine Rolle dieser Proteine von Xcv vorliegt und aufgrund des Fe-S-Clusters, sensorische Signale wie erhöhte Konzentrationen von Sauerstoff und ROS Induktoren für die Regulationen der Gene der Oxidasen sein können. Es ist denkbar, dass FLP und AcnA2 für eine effiziente Regulation der terminalen Oxidasen je nach verfügbarem Sauerstoff in Frage kommen bzw. eine Repression der Expression von cyd bei hoher O2-Konzentration stattfindet.
AcnA2 ist hierbei wahrscheinlich für die Feinregulation der Cytochrom-d-Oxidase-Synthese verantwortlich. Jedoch kann auch die Verfügbarkeit von Substraten Auswirkungen auf die Menge der terminalen Oxidasen haben. Es existieren Hinweise, dass die Menge des Cytochrom-d-Komplexes in der Zellmembran von E. coli von der verfügbaren Kohlenstoffquelle abhängig ist (Georgiou et al., 1987). Daher besteht die Möglichkeit, dass mehrere Faktoren einen Einfluss auf die Regulation und Menge der Oxidasen, auch in Xcv, besitzen.
Die Ergebnisse und Vermutungen dieser Arbeit werden zum Verständis des Zusammenspiels von FLP und den Aconitasen in Xcv beitragen und Anstöße für interessante Experimente zum Erlangen neuer Kenntnisse über die Bedingungen der Regulation der terminalen Oxidasen in Xcv liefern.
115 Xanthomonadaceae konserviert ist (3.1, Abb. 13). Es befindet sich in Xcc, Xoo, X. vasicola, X. albilineans, X. gardneri und S. malthophilia ebenfalls ein Gen direkt stromaufwärts eines acnB-ähnlichen Gens in gleicher Orientierung dessen Produkt Ähnlichkeit zu RoaY von Xcv aufweist.
Ebenfalls befindet sich ein acnA stromaufwärts und in divergenter Transkriptionsrichtung zu einem acnB Gen. Auch ist in den meisten Fällen ein roaX Gen stromaufwärts eines roaY Gens lokalisiert, außer im Fall von X. fastidiosa und X. fuscans. Bei E. coli und anderen Bakterien sind die Gene für Aconitasen nicht in unmittelbarer Nähe in Anordnung eines Operons zu finden und es existieren auch keine stromaufwärts- oder -abwärts liegende Gene, deren Produkte Ähnlichkeiten zu RoaX und RoaY aufweisen. Diese konservierte Anordnung unter einigen Vertretern der Familie Xanthomonadaceae deutet darauf hin, dass RoaX und RoaY die Aktivität oder Synthese von AcnB beeinflussen könnten.
Die Funktion von RoaX und RoaY bei der Regulation der Synthese von AcnB konnte, durch die Untersuchung einer Xcv roaX-roaY Deletionsmutante, verifiziert werden. Durch die Tatsache, dass das Fehlen der roaXY-Gene zu einer erhöhten Expression des acnB-Gens in Xcv führt (3.10, Abb. 22), belegte die Rolle von RoaX-RoaY als Regulatoren der Aconitase B.
Das putative Protein RoaX zeigt neben Ähnlichkeiten zu AbrB-Ähnlichen Proteinen, welche für die Genregulation beim Übergang einer exponentiellen in eine stationäre Wachstumsphase von Bedeutung sind (Strauch and Hoch, 1993), auch Ähnlichkeiten zu sogenannten Antitoxin-ähnlichen Proteinen der Toxin-Antitoxin-Systeme (TA-Systeme) (Unterholzner et al., 2013). Es handelt sich hierbei um ca.
9-12 kDa große Proteine, welche autoregulatorisch, durch Bindung an Promotorstrukturen aktiv sind.
Im Fall von Neisseria gonorrhoeae und dem Antitoxin FitA konnte gezeigt werden, dass die Komplexbildung mit einem Toxinprotein (FitB) essentiell für eine erfolgreiche Bindung an die DNA ist (Mattison et al., 2006). Antitoxine sind generell sehr instabile Proteine und unterliegen einem schnellen Abbau durch Proteasen. Aufgrund der hohen Identität von RoaX aus Xcv zu FitA aus N. gonorrhoeae und Ähnlichkeiten zu anderen Antitoxinen, wie z.B. MazE aus E. coli und VapB aus Shigella flexneri (Wesolowska, 2012) wird angenommen, dass RoaX und RoaY ebenfalls Komponenten eines TA-Systems in Xcv darstellen könnten. Das Genprodukt von roaY zeigt Ähnlichkeiten zu Proteinen mit PIN-Domänen (N-terminale Untereinheit von PilT-Protein-Domänen).
Hierbei handelt es sich auch oft um aktive, ca. 130 AS umfassende Toxine, welche aufgrund ihrer teilweisen Relation zur Pathogenität von Mikroorganismen oft auch als virulence associated protein (Vap) bezeichnet werden (Pandey and Gerdes, 2005). Interessanterweise konnte das Toxin in vielen Fällen als Endoribonuklease identifiziert werden, was für VapC aus S. flexneri gezeigt werden konnte (Mattison et al., 2006; Winther and Gerdes, 2011). Darüber hinaus zeigt RoaY von Xcv eine Identität von 100% auf der Aminosäureebene zu dem Toxin FitB aus S. flexneri (Mattison et al., 2006). Unter Betracht dieser Tatsachen ist es wahrscheinlich, dass es bei RoaY auch um eine Endoribonuklease handelt. In diesem Fall wäre eine endoribonukleolytische Funktion von RoaY im Zusammenhang mit
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116 einer verbesserten Translation von acnB-mRNA durch Spaltung von eventuellen Sekundärstrukturen denkbar.
Weitere Bestätigung einer erhöhten Synthese des AcnB Proteins konnte durch die Wachstumsanalyse in MA-Citrat-Medium einer Xcv roaX-roaY-Mutante sowie erstellten Einzelmutanten durch Einbringen von plasmidkodierten roaX bzw roaY in die Mutante (Xcv 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaX, Xcv 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaY (Wesolowska, 2012) erlangt werden (3.11, Abb. 23). Hierbei zeichnete sich die Xcv roaX-roaY Mutante, sowie der Stamm Xcv 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaY durch ein verbessertes Wachstum im Vergleich zum Wildtyp 85-10 und dem Stamm Xcv 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaX aus. Quantitative Vergleiche der Expression von acnB detektierten eine 3-fach erhöhte Transkription von acnB im Stamm Xcv 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaY im Vergleich zu einer roaX-roaY Deletionsmutante, welche bereits eine 3-fach erhöhte Expression im Vergleich zum Wildtyp aufwies (Wesolowska, 2012). Durch die erhöhte Synthese von AcnB im Stamm Xcv 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaY zeichnet sich dieser auch durch ein verbessertes Wachstum mit Citrat als C-Quelle aus, während eine Deletion von acnB zu reduzierten Wachstum von Xcv führt (3.11, Abb. 23). Da roaY in diesem Fall zwar gering exprimiert, aber in höherer Kopienzahl vorliegt als chromosomal exprimiert, führt eine erhöhte Menge von RoaY zu einer starken Induktion der Synthese von AcnB. Dies verdeutlicht ebenfalls die Rolle von AcnB als Hauptenzym des Citratstoffwechsels in Xcv.
Im Gegensatz dazu konnte im Xcv-Stamm 85-10ΔroaX-roaY/pL6roaX keine Transkription von acnB und auch keine Synthese eines AcnB Proteins nachgewiesen werden. Somit scheint eine Deletion von roaY und eine höhere Menge des putativen RoaX-Proteins die Expression von acnB stark zu reprimieren, während eine Deletion von roaX und eine höhere Menge von RoaY die Expression stark induziert. Offensichtlich liegt hier ein antagonistisches Zusammenspiel der beiden Proteine vor, wie es für bestimmte TA-Systeme bekannt ist (Bukowski et al., 2011).
Eine Repressoraktivität eines Antitoxins, wie es für RoaX denkbar wäre, konnte u.a. in E. coli für MqsA gezeigt werden (Wang and Wood, 2011). Hierbei hat die Bindung von MqsA an die Promotorstruktur von rpoS eine reprimierte Genexpression zur Folge. RpoS wird als ein wichtiger Sigmafaktor der Stressantwort postuliert. Da Toxine einem schnellen Abbau durch Proteasen unterliegen, führt die Anwesenheit solcher Proteasen zur Aufhebung der Repression von rpoS durch MqsA (Kim et al., 2010).
Einige TA-Systeme werden auch in Zusammenhang mit der Bildung eines Biofilms gebracht. Hierbei stellte MqsR/MqsA aus E. coli das erste TA-System mit Einfluss in eine derartige Funktion dar (Ren et al., 2004). Dabei zeigten Stämme, denen das TA-System fehlte eine reduzierte Biofilmbildung. Auch RoaX-RoaY von Xcv könnte als TA-System in die Biofilmbildung involviert sein. Eine Deletion von roaX-roaY hatte eine reduzierte Expression von gumF bei Transkriptomvergleichen zur Folge, was eine Acetyltransferase der Xanthan Synthese kodiert (3.12).
117 Ein anderer Vergleich der Transkriptome von Xcv 85-10ΔroaX-roaY mit dem Wildtyp zeigte zusätzlich eine reduzierte Transkription von gumJ (Daten nicht gezeigt), welches ebenfalls zum gum Gencluster von Xcv gehört und dessen Produkt eine putative Oligosaccharidyl-Lipid Flippase der Xanthan Synthese darstellt. Das gum Gencluster, welches aus 12 Genen (gumB-gumM) besteht, ist wichtig für die Xanthan Synthese und hochkonserviert unter Xanthomonas spp (Katzen et al., 1998;
Vojnov et al., 1998).
Durch viele Studien von TA-Systemen unterschiedlicher Mikroorganismen wurden eine Komplexbildungen zwischen dem Toxin und dem Antitoxin nachgewiesen, wodurch die Bindung des Antitoxins an die DNA verbessert wird, wie im Fall von FitAB aus N. gonorrhoeae (Mattison et al., 2006). FitB ist das Toxin mit Endoribonuklease-Aktivität dieses Systems. Die Aktivität von FitB wird durch die Bindung des Antitoxins FitA aufgehoben. Hier liegt, wie auch bei anderen TA-Systemen eine Autoregulation durch Bindung von FitAB an den eigenen Promotor vor. Da RoaY eine 100%ige Identität zu FitB aufweist, kann die Funktion von RoaY als ein Toxin mit PIN-Domäne vermutet werden. Ebenso könnte eine Komplexbildung von RoaX und RoaY stattfinden und eine Funktion eines TA-Systems tatsächlich vorliegen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass RoaX-RoaY vermutlich am Promotor des roaX-roaY-acnB Operons binden und RoaX durch die Sensierung eines spezifischen Signals nicht mehr zu einer Bindung von RoaY fähig ist (Wesolowska, 2012). Bei diesem Signal könnte es sich um Citrat, einen Metabolit, der von Citrat abstammt oder Stressbedingungen während der Pathogen-Wirt-Interaktion handeln. In B. subtilis schneidet das Toxin MazF, durch seine Endoribonuklease-Aktivität, aufgrund eines Stesssignals spezifische mRNAs, während unter normalen Bedingungen das Toxin inaktiv, durch Bindung des Antitoxins MazE, vorliegt (Simanshu et al., 2013).
Neben einer erhöhten Expression von acnB konnte in einer Xcv roaX-roaY Mutante durch Transkriptomvergleiche mit dem Wildtyp 85-10 auch eine erhöhte Expression von acnA beobachtet werden (Tab. 9). Somit hat RoaX-RoaY ebenfalls einen Einfluss auf die Expression von acnA. Dies liegt vermutlich in der gemeinsamen intergenen Region von acnA und roaX-roaY-acnB begründet, wo Regulationssequenzen der Transkription von acnA und der Transkription von roaX-roaY-acnB eng beieinander liegen.
Es besteht kein Zweifel, dass in Xcv ein Zusammenspiel zwischen den Aconitase-Proteinen und RoaX-RoaY besteht. Microarray-Analysen, wie auch quantitative Transkriptionsvergleiche einer Xcv acnA2 Deletionsmutante und dem Wildtyp mittels qRT-PCR, zeigten eine erhöhte Expression von roaY durch die Deletion von acnA2. Somit scheint AcnA2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von roaY zu haben, während RoaY anscheinend ein Aktivator der Expression von acnB und eventuell auch acnA darstellt. Somit könnten die gezeigten, erhöhten Synthesen von AcnB und AcnA in einer Xcv acnA2 Deletionsmutante auch durch die erhöhte Anwesenheit von RoaY zurückzuführen sein (3.20, Abb. 30; 3.21, Abb. 31). In diesem Zusammenhang wäre eine endoribonukleolytische Funktion von RoaY interessant und vorstellbar. Somit wäre zu untersuchen, an welcher Stelle die
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118 endoribonukleolytische Aktivität von RoaY in der Regulierung von acnA und acnB eingreift. Das Toxin MazF aus E. coli zeigte, ebenso wie RelE, eine Spaltung von mRNA in der ribosomalen A-Tasche, die zu einer Inhibierung der Translation führte (Christensen et al., 2003; Zhang et al., 2003).
Jedoch wäre es auch vorstellbar, dass eine spezifische Restriktion von mRNA, anstatt zu einer Inhibierung, auch zu einer verbesserten Translation führen könnte. Es wäre auch denkbar, dass RoaY als Toxin und Endoribonuklease eine translationsfördende Funktion besitzt. So könnte RoaY z. B. in seiner putativen Funktion als Endoribonuklease durch Spalten von Sekundärstrukturen der mRNA die Translationseffizienz von acnB Transkripten erhöhen. Obwohl die Gene roaX, roaY und acnB ein Operon bilden, befindet sich zwischen roaY und acnB ein intergener Bereich von ca. 50 bp, dessen Rolle unklar ist. Jedoch könnte dieser Bereich wichtige Bindestellen bzw. Sequenzsignale enthalten.
Durch Deletion dieses intergenen Bereichs könnten wichtige regulatorische Sequenzen identifiziert werden.
Eine Analyse der Expression von acnA und acnB in einer Xcv roaY-und in einer acnA2-roaY-Mutante wird mehr Aussagen über diesen Sachverhalt zulassen. Ebenso sollten die Transkriptmengen von roaX und roaY in dem Xcv-Wildtypstamm 85-10 analysiert werden. Des Weiteren würde die Analyse von Reporter-Fusionkonstrukten des roaX-roaY-acnB-Operons Aussagen über eine eventuelle Reprimierung durch RoaX und eine Aktivierung durch RoaY zulassen.