Die Rolle des cAMP/CRP-Komplexes

Ohne Zweifel besitzt die Adenylatcyclase eine wichtige Rolle bei der Katabolitrepression durch Nicht-PTS Kohlenstoffquellen. Dies zeigten die Ergebnisse der crp* Mutanten deutlich (Tab. 6). Nun stellte sich die Frage nach der Funktion des cAMP Rezeptorproteins CRP. Ist dieses Protein bei dem Phänomen des Glycerineffekts ebenso beteiligt? Ein wichtiger Hinweis, dass die Anwesenheit des Regulatorkomplexes notwendig für eine Repression ist, ergab die Untersuchung einer cAMP/CRP-unabhängigen malT-lacZ Fusion. Hier ist die malT Expression durch zwei Mutationen (malTp1 malTp10) im Promotorbereich verstärkt und infolgedessen eine Transkription auch ohne Aktivator möglich. Wie in Tabelle 7 ersichtlich, konnte in dieser Mutante keine der getesteten Kohlenstoffquellen mehr einen Einfluss auf die malT Expression ausüben. Daher muss Glycerin und andere Nicht-PTS Zucker, sowie die ebenfalls getestete Glucose, auf den cAMP/CRP Komplex einwirken, wodurch es zu einer Repression katabolit-sensitiver Gene kommt.

Doch beeinflusst G3P den gesamten Regulatorkomplex oder nur cAMP? Um die Frage der CRP-Beteiligung zu beantworten, muss man sich zwei mögliche Ziele betrachten.

Der erste Denkansatz basiert auf einer veränderten Affinität von cAMP zu CRP aufgrund von G3P. Dies hätte Auswirkungen auf die Aktivität des Transkriptionsregulators. Die zweite Möglichkeit wäre die Reduktion der Menge an cAMP Rezeptorprotein.

Es ist schon lange bekannt, dass die Bindung von cAMP an CRP die Transkription bestimmter Gene, hauptsächlich kataboler Systeme, aktiviert. Aufgrund von Ergebnissen aus spektroskopischen und chemischen Studien war sehr schnell klar, dass die Interaktion von cAMP mit seinem Rezeptorprotein eine Konformationsänderung bewirkt. Nur in dieser aktiven Konformation ist CRP befähigt an spezifische DNA Sequenzen zu binden und die Transkription in Anwesenheit der RNA-Polymerase zu

aktivieren. CRP* hingegen besitzt diese Struktur aufgrund des Austausches einer oder mehrerer Aminosäureresten auch ohne cAMP (Harman et al., 1986; Ren et al., 1988;

Garges & Adhya, 1988; Krueger et al., 1998).

Binden nun aber Substanzen an CRP, die keine Konformationsänderung zur aktiven Struktur bewirken oder eine Interaktion mit dem Effektor cAMP verhindern, so führt dies zu einer Hemmung der CRP-Aktivität. Beispiele dafür sind in der Literatur zu finden. So wurde von Botsford und Mitarbeiter ein oder mehrere dialysierbare Moleküle in Zellextrakten aus in Glucose gewachsenen Zellen gefunden, welche die Affinität von CRP für cAMP herabsetzen. Sie postulierten, dass es sich hierbei um ein Stoffwechselintermediat des Glucoseabbaus handelt, konnten es aber nie identifizieren (Danley et al., 1977). Der sogenannte „catabolite modulation factor“ (CMF) (Ullmann et al., 1976; Dessein et al., 1978) wird ebenfalls als Faktor beschrieben, der bei wachsenden Zellen eine starke Repression (bis zu 95%) bei katabolit-sensitiven Genen bewirkt.

cAMP/CRP-unabhängige Systeme sind hingegen nicht betroffen. Auch hier soll die Interaktion von cAMP und CRP beeinflusst werden.

Eine weitere interessante Beobachtung ist die Tatsache, dass z.B. cGMP (K_cGMP= 2,9*10^-4 M^-1) mit einer zu cAMP (K_cAMP= 3,9*10^-4 M^-1) vergleichbaren Bindekonstante an CRP bindet (Takahashi et al., 1980). Jedoch bewirkt die Interaktion keine Konformationsänderung und somit besitzt der cGMP/CRP Komplex keine Spezifität zu den CRP Boxen (Krakow & Pastan, 1973; Majors, 1975; Ebright et al., 1985).

Es wäre durchaus vorstellbar, dass G3P und andere Zuckerphosphate ebenfalls die Fähigkeit besäßen mit CRP zu interagieren. Hierfür gibt es zwei Möglichkeiten: Die Substanz bindet, wie cGMP, an der cAMP Bindestelle und verhindert eine Aktivierung des Regulators. Diese Kompetition müsste allerdings im Diagramm der relativen Fluoreszenzänderung in Abbildung 3 sichtbar werden. In diesem Experiment wurde die Konformationsänderung in Abhängigkeit von steigenden cAMP-Konzentrationen gemessen. Die Kurve der Messung in Anwesenheit von G3P ist zwar minimal nach oben verschoben, aber aufgrund der relativ hohen Streuung der Werte nicht relevant genug.

Aus diesem Grunde kann von keiner Veränderung der Affinität durch G3P gesprochen werden.

Die zweite Möglichkeit wäre eine Bindung von G3P an einer anderen Stelle des Proteins.

Für diese Allosterie wäre aber eine Konformationsänderung des CRP bei Zugabe von G3P notwendig, die über Fluoreszenzuntersuchungen auch nicht nachgewiesen werden konnte. Deshalb scheinen diese möglichen Mechanismen weitgehend unwahrscheinlich.

Obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass G3P die DNA-Bindeaffinität des aktiven Komplexes beeinflusst. Weitere Probleme waren die unphysiologisch hohe cAMP-Konzentration (im mM Bereich), die zur Messung eingesetzt werden musste.

Und die Tatsache, dass nur die Bindung an die zweite, niederaffine cAMP-Bindestelle gemessen werden konnte (Passner & Steitz, 1997). Demzufolge sind keine Aussagen über die erste affine cAMP-Bindung zu machen.

Als zweiter Arbeitsansatz musste überprüft werden, ob G3P Einfluss auf die Menge des cAMP Rezeptorproteins ausübt. Von Aiba und Mitarbeitern wird postuliert, dass die intrazelluläre Konzentration an CRP als ein wesentlicher Faktor zur Modulation des klassischen Glucoseeffekts beiträgt (Ishizuka et al., 1993, 1994). Nach ihrer Meinung kann der Mechanismus nicht alleinig, wie man bisher immer meinte (Kolb et al., 1993), auf der Reduktion des cAMP-Spiegels beruhen. Ishizuka et al. zeigten, dass Glucose die Menge an crp m-RNA erniedrigt und folglich die CRP-Menge in der Zelle senkt (Ishizuka et al., 1994). Damit widerlegten die Autoren die Behauptung Guidi-Rontanis, dass der gesuchte Mechansimus nichts mit CRP zu tun hat (Guidi-Rontani et al., 1980).

Auch der CRP* Spiegel in ∆cya crp* Mutanten wird durch Glucose beeinflusst (Tagami et al., 1995). Diese Senkung der CRP-Konzentration auf transkriptionaler Ebene korreliert mit der Wildtyp β-Galaktosidase Aktivität positiv. Steht crp unter der Kontrolle eines fremden Promotors, ist die Repression stark reduziert. Dieses Phänomen ist, so postulieren die Autoren, die Konzequenz aus der komplexen crp Regulation, welche abhängig von dem cAMP/CRP-Spiegel positiv und negativ durch den Komplex beeinflusst wird (Ishizuka et al., 1994; Hanamura & Aiba, 1992).

Dennoch scheint die Veränderung der CRP-Menge nicht der Mechanismus der Katabolitrepression durch Nicht-PTS Kohlenstoffquellen zu sein. In Western Blot Analysen wurde keine signifikante Reduktion der CRP bzw. CRP*-Konzentration in TB Glycerin Ansätzen der Stämme HS3084 (Abb. 4A) und ET23 (HS3084 ∆cya crp*) (Daten nicht gezeigt) gefunden.

Die Überexpression von CRP konnte die Glycerin-bedingte Repression der malK-lacZ Fusion im Stamm HS3084 ∆crp/pDCRP nicht aufheben (Abb. 4B), was für eine alleinige Rolle von cAMP spricht. In sensitiveren 2D-Gelen (Abb. 5) und im Western Blot der Zellen mit crp Plasmid (Abb. 4A) war zwar jeweils eine leichte Abnahme von CRP durch Glycerin zu erkennen, dies muss aber nicht auf einen direkten Einfluss dieser Substanz hindeuten. Viel wahrscheinlicher ist ein indirekter Effekt. Sinkt der intrazelluläre cAMP-Spiegel durch den Glycerineffekt, so führt dies zu einer verminderten Transkription aller cAMP/CRP-abhängiger Gene wie z.B. von malT, aber auch von crp. Da die cya Expression wiederum negativ durch den Regulatorkomplex reguliert wird, müsste sie sich unter normalen Umständen erhöhen. Da G3P einem cAMP-Anstieg entgegenwirkt, bleibt dies aber weitgehend ohne Auswirkung. Die Menge pendelt sich in einem etwas geringeren Pegel ein. Im Western Blot des CRP-Überexpressionsstamms, aber auch in den Wildtyp β-Galaktosidase Werten ließ sich die

Auswirkung dieser Autoregulation (Hanamura & Aiba, 1992) erkennen. Bei der Überproduktion von CRP in TB reduziert sich der cAMP-Spiegel etwas (Inada et al., 1991) und demzufolge auch die malK Expression. Im Experiment sank die spezifische β-Galaktosidase Aktivität der malK-lacZ Fusion in den TB-Kulturen um die Hälfte (Tab.

4B).

Auch Hogema et al. konnten für Glc6P, Lactose und Gluconat nur minimalste Auswirkungen auf die CRP-Konzentration nachweisen und schlossen daher zumindest eine alleinige Rolle dieses Proteins in der Repression durch Nicht-PTS Zucker ebenfalls aus (Hogema et al., 1997).

Die Resultate dieser Versuche fordern eine Rolle des cAMP zusammen mit dem Enzym IIA^Glc bei der Repression durch Glycerin und anderen Nicht-PTS Zuckern. CRP hingegen fällt keine direkte Bedeutung bei diesem Phänomen zu. Doch was ist der Mechanismus des Zusammenspiels dieser Komponenten?