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,.tg.111I
A#G#C#ATCTGGCACGT#G#G#T- 5'
I I
Fluorescein -3' 0, /08
o ~P, O~ '-.../' ./"'... '0' ""
# = Phosphordiester modifiziert als Thiotat (~ ) H oder Methylphosphonat (-CH3)
Abb. 8: Modifiziertes, mit Gallensäure verknüpftes Antisense-Oligonukleotid.
OH
sie eingesetzt werden, umfassen verschie-dene Kreb s arten , Virus- und Herz-Kreis-lauf-Erkrankungen, Asthma, Erkrankungen des Zentralnervensystems sowie Entzün-dungen. Im Handel ist Fomivirsen®, ein aus 21 Nukleosiden - den Grundbausteinen von Nukleotiden - bestehendes so genanntes 21-mer Phosphorthioat-Oligonukleotid ge-gen die Cytomegalovirus (CMV) -Infektion im Auge. Als nächstes Medikament G3139
wird ein 18-mer Phosphorthioat-Oligo-nukleotid gegen Lymphome voraussichtlich nächstes Jahr in den Handel kommen.
Ribozyme sind durch Derivatisierung schwieriger zu stabilisieren. Meist werden ModifIkationen am Zucker vorgenommen (Alkylierung der l"-OH Gruppe der Ribo-se oder Ersatz des Hydroxylrestes (OR) durch Fluor (F)). ModifIzierte Hammer-head-Ribozyme gegen Krebs, Viren und Infarkt befInden sich derzeit in Phase II-Studien. ANGIOZYME® ist als Hammer-head-Ribozym gegen den VEGF-Rezep-tor (vascular endothelial growth facVEGF-Rezep-tor) gerichtet und soll das Wachstum des En-dothelgewebes hemmen. Es spielt eine besondere Rolle im Herzkreislauf bei der Neubildung und Versorgung von Herz-muskelzellen.
Die entscheidende Hürde:
Wie gelangt das Oligonukleotid in die Zielzelle?
Wie kann der gezielte Zugang des Oli-gonukleotids in die entsprechende Zellart, in der es die mRNA hemmen soll, sicher-gestellt werden? Dazu dienen bestimmte Transportproteine, so genannte Carrier.
Gallensäuren sind z.B. geeignete Carrier für Oligonukleotide in Leberzellen (Abb.
8). In dem geschilderten Fall ist das Oli-gonukleotid gegen das Hepatitis C-Virus gerichtet, das sich in Leberzellen einni-stet. Das in Abbildung 8 gezeigte und von uns synthetisierte Antisense-Oligonukleo-tid ist in sehr geringen Konzentrationen in Leberzellen aktiv und hemmt dort die Vi-rusvermehrung des Hepatitis C-Virus.
Grundlage der Synthese modifizierter Antisense-Oligonukleotide und Ribozy-me ist die festphasenverrnittelte Oligonu-kleotidsynthese nach Letsinger-Caruthers.
Hierbei wird ein Nukleosid an eine feste
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Entschützung BasePG
Oligonukleotid • DMT'O~ BasePG
o R
DMno~
NC~ I
O-~~~effi
Träger--O R Träger--O RKupplung
R = OH, OCH3 , F, NH2, ...
PG = Aminoschutzgruppe
Abb. 9: Reaktionszyklus der RNA-Festphasensynthese nach Letsinger-Caruthers.
Phase, meist Glas oder Kunststoff, gebun-den. Durch eine stets wiederkehrende Ab-folge chemischer Reaktionen entsteht ein Oligonukleotid (Abb. 9). Bei dieser heute voll automatisierten Synthese handelt es sich um eine ausgefeilte und effiziente Schutzgruppenstrategie - Schutzgruppen sind reversible chemische Modifikationen (Maskierung und Demaskierung cherni-scher Gruppen) in einem polyfunktionel-len Molekül. So können Ausbeuten über
Professor Dr. Joachim W. Engels (57) stu-dierte von 1964 bis 1968 Chemie in Berlin und München und wurde 1972 an der Uni-versität Regensburg in der Organischen Chemie promoviert. Nach einem For-schungsaufenthalt an der Stanford Uni-versität in den USA habilitierte er sich 1979 an der Universität Konstanz. 1980 wechselte Joachim Engels in die Indu-strie. Im Rahmen dieser Tätigkeit ging er zu einem weiteren Forschungsaufenthalt an die University of Colorado in Boulder, USA. 1985 folgte er einem Ruf an die Goe-the-Universität Frankfurt als Hochschul-lehrer für Organische und Biologische Chemie. Joachim Engels ist Autor von 165 Publikationen und 24 Patenten. Er war fünf Jahre in der IUPAC Biotechnology Group als Titulary Member, ist im Editorial Board von Antisense & Nucleic Acid Drug
99 Prozent erreicht und Oligonukleotide in großen Mengen von beachtlicher Län-ge (bis zu 200 Bausteine) hergestellt wer-den. Vor wenigen Jahren noch war es un-vorstellbar, dass diese Synthesen zu be-zahlbaren Produkten führen könnten.
Das Konzept der Antisense-Oligonu-kleotide ist wegen seiner Generalisierbar-keit besonders attraktiv: Für jede Gense-quenz des menschlichen Genoms kann ein Antisense-Oligonukleotid abgeleitet
Development, Mitglied mehrerer wissen-schaftlicher Gesellschaften und leitet die Fachgruppe Biochemie der Gesellschaft Deutscher Chemiker. Seine Arbeitsgebie-te sind die biologische Synthese von Pharmaproteinen, die Protein-Faltung, die Entwicklung synthetischer Methoden zur Herstellung modifizierter Oligonu-kleotide (Antisense, Triple-Helix, Ribo-zym) sowie die Synthese und Strukturauf-klärung von RNA. Darüber hinaus be-schäftigt sich der Chemiker mit der Ent-wicklung schneller DNA- und RNA-Se-quenzierungsmethoden durch Fluores-zenzspektroskopie und Massenspektro-metrie sowie der Entwicklung von kombi-natorischen Chemiebibliotheken.
Joachim Engels ist seit Oktober 2000 De-kan des Fachbereichs Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften.
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werden. Jedoch haben verschiedene Ver-suche gezeigt, dass nicht alle Boten-RNA für Antisense-Oligonukleotide zugänglich sind. Während Antisense-Oligonukleotide im Bereich des Translationsstartpunktes (Start der Proteinsynthese), der AUG-Se-quenz, eine hohe Trefferwahrscheinlich-keit im Sinne von Bindungsaffinität und Wirksamkeit haben, ist die übrige RNA nur zum Teil zugänglich. Dies muss im Einzelfall durch Experimente bestimmt werden. So ist es auch heute trotz compu-tergestützter Vorhersagen der mRNA-Struktur noch nötig, etwa 20 Oligonu-kleotide pro Zielsequenz zu synthetisieren und auf ihre Wirksamkeit zu testen, um eine geeignete zu finden. Für
Funktions-studien der bekannten Genome, von Mensch über Maus, Wurm und Fisch wird dies in zunehmendem Maße durchgeführt.
Gegenwärtig ist nicht absehbar, ob Anti-sense-Oligonukleotide und Ribozyme so-wie RNAi eine größere Bedeutung für Funktionsstudien oder als Therapeutika haben werden. Dem d~rzeitigen Credo der pharmazeutischen Industrie zufolge soll-ten Pharmaka nicht über ein Molekularge-wicht von 600 Dalton, der GeMolekularge-wichtsein- Gewichtsein-heit von Atomen und Molekülen, hinaus-ragen, da sich kleine Moleküle als Wirk-stoffe in Tabletten besser eignen als gro-ße, die in der Regel intravenös injiziert werden müssen. Solche kleinen Moleküle für die Translationskontrolle zu finden, ist
erklärtes Ziel des Sonderforschungsberei-ches "RNA-Liganden-Wechselwirkun-gen" (vgl. Informationskasten "Die mole-kulare Erkennung von Ribonukleinsäure (RNA)", Seite 62).
Wie aus den hier vorgestellten Bei-spielen ersichtlich, sind schon eine Reihe neuartiger Wirkstoffe auf der Basis der Antisense-Oligonukleotide und Ribozy-me entdeckt worden und haben Eingang in die Therapie gefunden. Um jedoch den ganz großen therapeutischen Erfolg zu verzeichnen, bedarf es der kleinen Wirk-stoffmoleküle.
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