Die Isolierung von Parasitophorous Vacuolar Membrane-Enclosed Merozoite

Membrane-Enclosed Merozoite Structures (PEMS)

Nach der Invasion von Merozoiten in Erythrocyten nisten sich die Parasiten in der Wirtszelle ein und durchlaufen ihren Entwicklungszyklus. Dabei bleibt der Parasit für die gesamte Dauer der Differenzierung von der PVM umgeben. Um erneut Erythrocyten zu befallen und damit den intraerythrocytären Entwicklungszyklus aufrecht zu erhalten, müssen die neu entstandenen Merozoiten sowohl die Wirtszelle als auch die PV verlassen. Wie dieser Evasions-Prozess genau abläuft ist unbekannt, doch sind einige Modelle dazu aufgestellt worden (zusammengefaßt in Lew, 2001). Proteasen scheinen bei der Evasion der Merozoiten eine wichtige Rolle zu spielen (Hanspal et al., 2002a; Raphael et al., 2000; Rosenthal, 1998).

Lyon und Haynes (1986) beobachteten, dass in Gegenwart einer Reihe von Protease-Inhibitoren eine verminderte Reinvasionsrate der Merozoiten auftritt und es zur Bildung von Merozoiten-Clustern kommt, die von der Erythrocyten-Membran umgeben sind. Salmon und Kollegen (2001) untersuchten die Wirkung des Cystein-Protease-Inhibitors E64 auf die Freisetzung von Merozoiten und fanden ebenfalls, dass es zur Bildung von Merozoiten-Clustern kommt. Es wurde aber gezeigt, dass diese Cluster nicht von der Erythrocyten-Membran umgeben sind, wie es Lyon und Haynes festgestellt haben, sondern von der PVM.

Daher wurden solche Strukturen als PVM-Enclosed Merozoite Structures (PEMS) bezeichnet.

Es wurde postuliert, dass Merozoiten in zwei Schritten freigesetzt werden: Merozoiten sollen zunächst innerhalb der PVM aus dem Erythrocyten freigesetzt werden und dann erst soll es zur Entlassung der Merozoiten aus der PVM kommen.

In der vorliegenden Arbeit wurde das Protokoll von Salmon und Kollegen (2001) übernommen und modifiziert, um PEMS zu präparieren. In Giemsa-gefärbten PEMS-Präparaten konnten keine Wirtszellen ausgemacht werden, im deutlichen Unterschied zu iRBC, die als Kontrolle dienten. Die Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFA) bestätigte die Ergebnisse von Salmon et al., nämlich, dass die PEMS tatsächlich von der PVM umgeben waren. EXP-1, ein Protein der PVM, konnte nicht zusammen mit dem humanen Bande 3-Protein der Erythrocyten-Membran um die PEMS herum lokalisiert werden. Dennoch konnten auch iRBC in der Präparation ausgemacht werden. Kleine Bereiche an der Peripherie der PEMS zeigten meist die Präsenz des Bande 3-Proteins an. Es wäre möglich, dass

Membranfragmente der RBC-Plasmamembran beim Austreten der PEMS entstehen, die dann zumindest vorübergehend an der PVM haften bleiben. Eine andere Möglichkeit wäre, dass die PVM über das Tubovesikulare Netzwerk (TVN) mit der Erythrocyten-Membran verbunden ist (Haldar et al., 2001) und die Merozoiten an diesen Stellen mit der PVM austreten. Dabei könnte an der Verbindungsstelle von TVN und Erythrocyten-Membran etwas Material aus der RBC-Plasmamembran herausgerissen werden, was dann typischerweise das Bild einer kleinen

„Fahne“ an den PEMS in den IFA-Untersuchungen abgibt. Dies wäre nicht in Übereinstimmung mit der These von Winograd und Kollegen (1999). Sie schlugen die Bildung einer Öffnung in der Wirtsmembran und der PVM vor, was zur Evasion der Merozoiten und zur Fusion von PVM und RBC-Membran führen soll. Vielmehr scheint sich nur – zumindest in Gegenwart von E64 - die Erythrocyten-Membran zu öffnen. Die PVM fusioniert demnach nicht mit der RBC-Membran und bleibt um die freigesetzten Merozoiten erhalten.

Das Protokoll zur Isolierung von PEMS wurde insoweit modifiziert, dass vor der Inkubation mit E64 die Parasiten aus einer Kultur angereichert wurden. Dies ergab zu Beginn des Versuchs eine bis zu 97 %ige Parasitämie. Es waren also kaum nichtinfizierte Erythrocyten im Ausgangsmaterial enthalten. Dies konnte in der Immunfluoreszenz bestätigt werden.

Solche Präparationen wurden dann E64 ausgesetzt, wodurch die PEMS erhalten wurden.

Gleichzeitig aber konnte mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie festgestellt werden, dass ein großer Anteil von Erythrocyten-Membranen ebenfalls in der Präparation vorhanden war.

Somit kann gefolgert werden, dass die PEMS aus den Wirtszellen austreten, ohne diese komplett zu lysieren. Dies konnte mittels IFA auch daran erkannt werden, dass die PEMS nach ihrem Austritt aus der Wirtszelle diese bzw. die Wirtszell-Membran zurücklassen. Durch differentielle Zentrifugation konnten diese Membranen nicht entfernt werden und sedimentierten zusammen mit den PEMS. Somit konnte auch auf einem Western-Blot Bande 3-Protein in der PEMS-Präparation nachgewiesen werden, wenn auch die Banden-Intensität im Vergleich zu nichtinfizierten Erythrocyten geringer war.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass bei rund 50 % der Merozoiten-Cluster nur eine Membran vorhanden war. In den Fällen, in denen zwei Membranen zu finden waren, handelte es sich bei der inneren um die PVM und bei der äußeren um die Plasmamembran der Wirtszelle. Dieses Ergebnis wurde schon von Lyon und Haynes für andere Protease-Inhibitoren beschrieben (Lyon und Haynes, 1986). Außerdem waren die

Präparationen durch Erythrocyten-Membranen kontaminiert, was konsistent mit den IFA-Untersuchungen war. Bei Merozoiten-Clustern, die durch nur eine Membran umgeben waren, handelte es sich tatsächlich um PEMS. Auffällig war, dass kein elektronendichtes Material innerhalb der Erythrocyten-Membranen zu erkennen war. Vermutlich wurden die Wirtszell-Membranen permeabilisiert, bis es zur Evasion der Merozoiten kam. Ob dieser Effekt durch E64 oder durch Proteasen zustande kommt, ist fraglich. Allerdings scheint E64 diesen Effekt nicht zu verhindern, so dass ausgeschlossen werden kann, dass Cystein-Proteasen die einzige Ursache für die Permeabilisierung sind. Eventuell führen Lipasen zur partiellen Lyse der Wirtszell-Membran, so dass diese permeabilisiert wird (Roggwiller et al., 1998). Im Laufe dieser Lipolyse könnten dann PEMS freigesetzt werden. Die Lipolyse beträfe aber nicht die PVM, obwohl sie z. T. aus den Lipiden der Erythrocyten-Membran bestehen soll (Lingelbach und Joiner, 1998). Dies bedeutete, dass die Merozoiten-Cluster innerhalb der PVM und der Erythrocyten-Plasmamembran eine Vorstufe der PEMS wären.

Bezüglich der Reinheit der PEMS-Präparationen muss hier betont werden, dass Salmon und Kollegen (2001) ihre Analysen mit Zellen aus einer E64-inkubierten Kultur durchgeführt haben. Weitere Reinigungsschritte zur Trennung der PEMS von infizierten und nichtinfizierten RBC wurden zwar beschrieben, aber nicht mittels IFA oder Elektronenmikroskopie überprüft. Die Giemsa-Färbung präparierter PEMS wurde dokumentiert und zeigte keine Unterschiede zu dem hier Beschriebenen. Dennoch war in dieser Arbeit erst durch IFA feststellbar, dass die Präparationen Erythrocyten-Membranen enthielten.

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass sowohl die Ergebnisse von Lyon und Haynes als auch die von Salmon und Kollegen bestätigt worden sind. Merozoiten-Cluster wurden sowohl innerhalb als auch ausserhalb der Wirtszell-Plasmamembran in der Präparation gefunden. Die PEMS verlassen mit der PVM den Erythrocyten. Die Freisetzung der PEMS geschieht ohne die totale Zerstörung der Erythrocyten-Plasmamembran. Dies ist in Einklang mit der Theorie von Salmon und Mitarbeitern, dass die Evasion der Merozoiten ein Prozess ist, der in zwei Schritten abläuft. Das Schicksal der Wirtszellen nach der Evasion wurde in deren Arbeit aber nicht untersucht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass die PEMS die Wirtszelle verlassen, und dabei kleine Stücke der Erythrocyten-Membran mitreißen. Dies könnte bedeuten, dass der Parasit an denjenigen Stellen die Wirtszelle zuerst verläßt, an der das TVN mit der Erythrocyten-Membran verbunden ist. Folglich gäbe es keine zufällige

Austrittspforte für den Parasiten aus der Wirtszelle, sondern prädestinierte Bereiche für die Evasion.