3.4 Identifizierung ausgesuchter Phosphoproteine
3.4.4 Die Identifizierung von pE1/E50u1
Durch massenspektrometrische Analysen, de novo-Sequenzierung und "Mascot" -Suche mithilfe der ermittelten MS-Daten (siehe 2.2.11) wurden aus dem Spot pE1/E50u1 folgende Peptide identifiziert3:
Peptid I : DEIFCLFEGALDNLGSLK (Fragment von Peptid II) Peptid II : SFAVKDEIFCLFEGALDNLGSLK
Peptid III : SANEVMLVIEAYK
Peptid Observed Mr (expt) Mr (calc) Delta Miss Score Expect I 1020,9039 2039,7933 2039,9874
-0,1941
0 70 7,6 ∙ 10-5 II 858,4052 2572,1938 2572,2883
-0,0945
1 22 3,2
III 741,8718 1481,7290 1481,7435 -0,0145
0 92 6,2 ∙ 10-6
Tab. 3-3 Mascot Ergebnisse der gefundenen Peptide für pE1/E50u1.
(Observed: gemessenes Masse- Ladungsverhältnis, Mr (expt): um die Ladung bereinigte gefundene Masse, Mr (calc): theoretische Masse des angegebenen Peptids, Delta: Differenz aus Mr (expt) und Mr (calc), Miss: im Peptid noch vorhandene Trypsinspaltstellen, Score: Ionscore, gibt an wie gut ein experimentell ermitteltes Spektrum zu dem simulierten Spektrum des identifizierten Peptides passt, Expect:
Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Treffers (Zufallstreffer))
Diese Peptide wurden in einer Reihe pflanzlicher Proteine gefunden. Die höchsten Übereinstimmungen traten mit einem "aluminium induced protein" in Codonopsis lanceolata (AY835928), Avicennia marina (AF363286) und Gossypium hirsutum (AY368487), sowie einem "hypothetical protein" in Solanum tuberosum (ABA46788) auf.
Die Aminosäuresequenzen dieser Poteine im Vergleich zeigt Abb. 3-18.
Die Suche nach der Sequenz dieses "aluminium-induced-like proteins" in einer noch unvollständigen Datenbank, die ESTs aus Eschscholzia californica enthält (http://pgn.cornell.edu), blieb leider ohne Ergebnis. Daher wurde versucht, mittels PCR sowie durch ein cDNA-bank-screening das Gen und damit die AS-Sequenz dieses Proteins in Eschscholzia californica zu ermitteln.
3 durchgeführt von Dr. Christian Schmelzer et al., Institut für Phamazeutische Technologie und Biopharmazie, MLU Halle-Wittenberg
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5 15 25 35 45 55 65 75 AY835928 MLGVFSSSIM SPPEELVAAG SRTPSPKITA TALVNRFLKS NASAVSMQVG DDVHLAYTHH NESPSAPRSF AVKDEIFCLF AF363286 ...V ...D... ...VA. .K..G...EA .S....VKI. ..AQ... .Q.ALR.... ...
AY368487 ...A.V ...D... C... D...K...ET .S.G...HI. .H.QF..S.. K...LQ.... ...
ABA46788 ...V ... ...S D...VQR .S..I...I- .F.Q...S.S ...AVL.... ....D...
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85 95 105 115 125 135 145 155 AY835928 EGALDNLGSL KQQYGLSKSA NEVVLVIEAY KALRDRAPYP PNHVVGHLEG NFAFVVFDKS TSTLFVATDQ AGKVPLYWGI AF363286 ... ...G... ...L... ... .S...Q. ....I... ...E FA...
AY368487 ... ...A... ...I... ... ...I. S...I... ...S.. F...
ABA46788 ..S... R...A... ...M... ... ... ....I... ... V...
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165 175 185 195 205 215 225 235 AY835928 TADGYVAFAN DADLLKGACG KSLASFPQGC FYSTAVGELR CYENPKNKIT AVPATEEEIW GAKFMVEGPG VLTATE----
AF363286 ...D ... ... .F...I. S... ....Q... ... MIA.SK---- AY368487 ...D N.E... ... ...G.. S... ....E... ....K....A .VA...---- ABA46788 ... ... ... ....T..G.. S...TRSP PFLLLRKKYG ALSLWWKVQL L.QPLNRRFR ....|....| ..
245 AY835928 --- -- AF363286 --- -- AY368487 --- -- ABA46788 FSSLSSEGKT RP
Abb. 3-18 Vergleich der AS-Sequenzen von "aluminium induced proteins", bzw. einem "hypothetical protein" verschiedener Pflanzen nach Mascot-Suche mit MS-Daten.
("." = Übereinstimmung mit erster Sequenzzeile,"-" = Lücke, blau = homolge Bereiche zu via MS-identi-fizierten Peptiden)
Für die PCR wurden die Primer "Alu_for" und "Alu_rev" aus den stark homologen Bereichen der AS 81 bis 87 ("für Alu_for") und AS 208 bis 214 (für "Alu_rev") mithilfe des codon usage von Eschscholzia californica (http://www.kazusa.or.jp /codon/) abgeleitet [Tab. 2-2]. Der zu amplifizierende Bereich umfasst 133 AS und sollte mit cDNA template eine Bande von ca. 400 bp liefern. Erhalten wurde jedoch eine Bande von ca. 900 bp [Abb. 3-19] deren DNA-Sequenz nur eine sehr geringe Homologie zu der Gensequenz des
"Al-inuced-protein" aus Gossypium hirsutum (< 40 %) und Codonopsis lanceolata (< 38 %) zeigte [Abb. 3-20].
Abb. 3-19 Ergebnis der PCR zur Identifizierung der Sequenz des "Al-induced-like proteins" Gens in Eschscholzia californica.
1% Agarose Gel mit PCR Produkt Template: cDNA Eschscholzia californica
Primer: Alu_for / Alu_rev Annealingtemperatur:
1 - 57,7 °C 2 - 56,9 °C M - Marker
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5 15 25 35 45 55 65 75 Gosyypium --- --- --ATGTTGGG AGT-ATTTAG CAGTGCGATA GTGTCTCCGC CGGACGAGCT GGTGGCGGCC Codonopsis --- --- --... ...-G... ...CT.A... A....G..A. ....G... ...T...
Seq. f.PCR GGGTGCTTCT TGATAATCTG CGGCTA...C .T.AGC.G.. .GTCTGCG.G A..A-ATTA. ...G..T.AA AT..AT.A..
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85 95 105 115 125 135 145 155 Gosyypium GGTTGCCG-A ACTCCATCAC CTAAGATAAC GGCGGACGCT CTGGTGAAAC GGTTCCTTGA GACG--AACT CCTCCGGCGT Codonopsis ...A.T..-. ..A..G.... .G...C.. ....ACG..G ...C. ...CA. AT.A--...G .T..G.CG..
Seq. f.PCR AACCA.G.CG G.GG..A.TT TA.GA.AC.G TTT.CC..TG ...A.A..TG ..G.G.CC.C .TT.CTGTGG TGCTG..T.A
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165 175 185 195 205 215 225 235 Gosyypium GTCCATGCAC ATCGGAGACC ATGTCCAATT CGCTTATTCT CACCATAAAG AGTCTCCTTT ACAGCC-CAG ATCATTTGCT Codonopsis ...G G....C..TG .C..T..T.. G...CA.. ...C..C. ....C..G.C CGCT..-... ...G Seq. f.PCR ...TGAAGTG GCTAAC.G.A CA.CAGT.G. GAAGG...TG .G.TC.GGT. ..CAAA.GGC .GTTG.G... GAT.GCGTAG
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245 255 265 275 285 295 305 315 Gosyypium GTGAAAGACG AAATCTTCTG CTTGTTTGAG GGAGCCCTTG -ATAACTTGG GGAGTTTAAA GCAGCAATAT GGTCTGGCAA Codonopsis ..T...T. .G..T... ... ...A..A. -.C...A. .T...C.G.. ...G..C ...CT.T.
Seq. f.PCR CC.CGCATTT GCGCACGT.A ..G.G..A.. .A..GAGAA. G.C.G.G... AA.T..ACG. .A.CG..A.C .AC.A..T.G
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325 335 345 355 365 375 385 395 Gosyypium AGTCAGC-AA ATGAAGTGAT ATTGGTCATT GAAGCTTACA AGGCCCTTCG -TGACCGAGC ACCTTATCCT CCAAACCATG Codonopsis ....T..-.. .C..G..CG. T... ..G..C.... .A..T... -C...G.. T... ..C...
Seq. f.PCR .AG.G.TT.. .C.CTT.TT. GC..AAA..G .C.AAGC..T G.CTGT.GG. G...TTTT.G G.G..GG.GC A.TG.TTGGC
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405 415 425 435 445 455 465 475 Gosyypium TGG---T TGGCCATCTA ATTGGG-AGC TTTGCT---T TCATTGTCTT TGATAAATCC ACCTCCACTT TGTTTGTGGC Codonopsis .T.---. G..A...G GAA..A-.AT ...A---. .TG.G... ...C..G..A ...G..A. ...
Seq. f.PCR ...CGCTAC. G.AA..G.C. TCA..TTGAT .C...ACGC. C.GC.TCTC. ..CCT.TCAA .ATG.GGT.A CCGCA...AG
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485 495 505 515 525 535 545 555 Gosyypium TTCTGATCAA TTTGGTAAGG TTCCTCTCTA TTGGGGAATC ACCGCCGACG GATATGTGGC CTTTGCTGAT AATGCTGAAT Codonopsis .A.C..C... GC... ....G..A.. ... ..T..T..T. .G... A...A.. G...T.
Seq. f.PCR CGAA.GCA.. CCG.A..GCA .C..G--GCG GC..AA..AT -TT..T.CT. A.A..AAAAA TAC.TA..G. G-C....GC.
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565 575 585 595 605 615 625 635 Gosyypium TGCTGAAAGG TGCCTGTGGC AAATCTCTTG CTTCTTTCC- CTCAAGGCTG TTTCTACTCC ACAGCAGTAG GAGGATTAAG Codonopsis ... ...T... ..G..A.... ...- ...T.. ...T... ...C. ...A.C.T..
Seq. f.PCR .CT.TGG.AC .-TGC.CA.. ..T.TGT.GA .AAAAA.GAA ..AG..AAA. C.G.CG.C.A GTTA..AC.. .G.CTGGC..
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645 655 665 675 685 695 705 715 Gosyypium A----AGCTA TGAGAATCCT AAGAACAAGA TCACTGCAGT GCCTGC---T GAAGAAGAGG AGATATGGGG TGCTAAATTC Codonopsis .----T.... ... ...A. ....A..C.. T...---C ACT..G..A. .A..C... G...
Seq. f.PCR .CACG...G. ...A....TC ..AGC.GT.. .A.A.CTGCG T.T...TCGC .TTC.G.TAC ..C.CAA.CA G...G.TGC.
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725 735 745 755 765 775 785 795 Gosyypium AAGGTGGAAG GGCCAGCTGT TGTTGCTGCC ACAGAGT--- --- --- --- --- Codonopsis .T...T.... ...GA.. .C..A.A... ...--- --- --- --- --- Seq. f.PCR GC.C..A..A CC.TT.A.AC CA.CAAA.GT GA..G..GGG CTGCCATTGT TGCCGACCTG CGTGGTGAAG CATTGCTGAG
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805 815 825 835 845 855 865 875 Gosyypium --- --- --- --- --- --- --- --- Codonopsis --- --- --- --- --- --- --- --- Seq. f.PCR CAAAGGTGAT AAGCAAGGTG CGCGTAGTGC ATGGGAAGCA GGCGTGAAAA GCGATGTTAC TCCGGCACTG AGCGAAATGA
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885 895 905 915 Gosyypium --- --- --- --- Codonopsis --- --- --- --- Seq. f.PCR TGCAGATGAA AATTAATAAT T-GTCCATCT GAGAC
Abb. 3-20 Alignment der Gensequenzen der "Al-induced proteins" aus Gossypium hirsutum und Codonopsis lanceolata mit dem sequenzierten PCR Produkt aus Eschscholzia californica.
("." = Übereinstimmung mit erster Sequenzzeile,"-" = Lücke)
Nachdem die Gensequenz dieses Proteins mithilfe von PCR-Techniken nicht zu ermitteln war, wurde mithilfe des durch de novo-Sequenzierung bestätigten Peptid II (SFAVKDEIFCLFEGALDNLGSLK) wiederum unter Zuhilfenahme des codon usage von Eschscholzia californica (http://www.kazusa.or.jp/codon/) eine DNA-Sonde für ein cDNA-Bank-screening mit folgender Sequenz synthetisiert:
TCATTTGCTGTTAAAGATGAAATTTTTTGTCTTTTTGAAGGTGCTCTTGATAATCTTGGTTCACTTAAA
Das cDNA-Bank-screening erfolgte wie unter 2.3.6 beschrieben in einem Zwei-Schritt-Auswahlverfahren. Das Ergebnis des zweiten screening-Durchgangs zeigt Abb. 3-21. Die nummerierten Klone wurden gepickt und in 10 ml LB-Kan Medium über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die aus diesen Kulturen isolierte Plasmid-DNA (siehe 2.3.1.2) wurde zur Über
-prüfung sequenziert.
Abb. 3-21 Ergebnisse des zweiten cDNA-Bank-screening-Durchgangs.
Auch diese Sequenzen wiesen nur wenig Homologien (durchschnittlich < 40 %) zu den Gensequenzen der "Al-induced proteins" aus den angegeben Pflanzen auf. Jedoch fanden sich Bereiche, die eine Ähnlichkeit zwischen 61 % (Klon I/1, Abb. 3-22 A) und 51 % (Klon I/3, Abb. 3-22 B) zu der eingesetzten DNA-Sonde aufwiesen. Damit ist die positive Selektion dieser Klone im screeening-Prozess zu erklären.
A - cDNA Bank Kulturen (Schale I) B - entwickelter Fotofilm nach screening-Durchgang (Schale I) C - cDNA Bank Kulturen (Schale II) D - entwickelter Fotofilm nach screening-Durchgang (Schale II)
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5 15 25 35 45 55 65 75 Sonde TCATTT---G CT-GTTAAAG A---TGAAAT T---TTTTGT CTTTTTG--A AGGTG-CTCT TGATAATCTT GGTTCACTTA AA Klon I/1 ...G..AGC. ..A...GC.. .ACT.C.... .CAA... GG.AA..TA. ..A..A.... ..---... AC..---... ..
A
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5 15 25 35 45 55 Sonde TCATTTGCTG TTAAAGATGA AATTTTTTGT CTTTTTGAAG GTGCTCTTGA TAATCTTGGT TCACTTAAA Klon I/3 A...AT.A GG.GTA.CT. ...A..AG.. TGA...TC A.TA.GG-.. A...CTC .GGT...GC
B
Abb. 3-22 Alignment homologer DNA Bereiche der Klone I/1 (A) und I/3 (B) zur DNA Sonde.
Ein zweites cDNA-Bank-screening, das zur Steigerung der Sondenselektivität mit einer erhöhten Hybridisierungstemperatur von 60 °C (statt der zuvor gewählten 55 °C) durch-geführt wurde, führte zu einem ähnlichen Resultat (Daten nicht gezeigt). Auch hier ließ sich die gesuchte Gensequenz in Eschscholzia californica nicht auffinden. Offenbar ist die benutzte Sonde für ein solches screening unzureichend selektiv.