Die genetisch veränderte Maus

Für die Experimente dieser Doktorarbeit wurden zwei Mauslinien (jeweils Wildtyp- und Knockout-Geschwister) untersucht. Es handelt sich dabei um den Knockout der δ Isoform der CaMKII (CaMKIIδ^-/-, Backs et al. 2009) und den Knockout der katalytischen Untereinheit der NADPH Oxidase 2 (gp91^phox-/-, Pollock et al. 1995).

2.1.1 Das Prinzip der Knockout-Maus

Knockout-Mäuse sind Mäuse, die durch genetische Manipulation (Gene targeting) ein oder mehrere deaktivierte Gene haben. Um diesen Zustand zu erreichen, werden aus Blastozysten von Inzuchtmäusen embryonale Stammzellen entnommen und in vitro kultiviert. Anschließend wird ein Inaktivitätsvektor z.B. durch Elektroporation (mittels eines elektrischen Felds) in die Stammzelle übertragen. Der Inaktivitätsvektor ist ein künstlich hergestellter DNA-Abschnitt, der aus dem zu inaktivierenden Gen besteht, das deergestalt mutiert ist, dass es nicht transkribiert wird (bzw. das entstehende Protein inaktiv ist).

Einige der so behandelten Stammzellen haben durch das natürliche Prinzip der homologen Rekombination den neuen DNA-Abschnitt anstelle des funktionsfähigen Gens in ihre Chromosomen eingebaut. Dieses ist möglich, da die neue und die alte DNA-Sequenz sich sehr ähneln. Die homologe Rekombination tritt jedoch nur sehr selten auf. Deshalb benötigt man einen Resistenzfaktor, der mit dem Gen übertragen wird. Die so veränderte Stammzelle kann nach Inkorporation des mutierten DNA Abschnittes einen Resistenzfaktor für ein Zytostatikum (z.B. Neomycin) exprimieren.

Die mit Neomycin behandelten Stammzellen, welche resistent sind können sich weiter teilen und haben gewissermaßen einen Selektionsvorteil, während die Wildtypen

„ausselektiert“ werden.

Anschließend werden die erfolgreich veränderten Stammzellen in eine Maus-Blastozyste übertragen und einer vorbehandelten Empfängermaus (Ammenmaus) eingepflanzt. Die so entstandenen chimären Mäuse, die sowohl veränderte wie nicht

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veränderte Zellen in allen Geweben enthalten, werden mit Wildtyp-Mäusen weiter gekreuzt. Die meisten dabei entstehenden Mäuse sind homozygot gesund, aber einige von ihnen tragen das veränderte Gen, weil die Ei- bzw. Samenzelle von der eingesetzten Stammzelle stammt. Diese Tiere sind uniform heterozygot und haben im Gegensatz zu den chimären Mäusen in allen Zellen dieselbe genetische Information, nur liegt diese Information in jeder diploiden Zelle einmal in nicht veränderter und einmal in veränderter Form vor (heterozygot). Kreuzt man diese untereinander, erhält man in 25% der Fälle homozygote Mäuse, die nur noch das inaktive Gen besitzen (Capecchi 1989).

Abb. 2.1: Herstellung der Knockout-Maus schematisch dargestellt (modifiziert nach http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bf/Knockout_mouse_production_2.svg/566px -Knockout_mouse_production_2.svg.png)

2.1.2 Herstellung der CaMKII-Knockout- und der gp91^phox-Knockout-Maus

Bis 2009 war die CaMKIIα die einzige Isoform der CaMKII, bei der es gelungen war, das dafür codierende Gen in experimentellen Versuchen auszuschalten. 2009 gelang es erstmals, ein entsprechendes Verfahren für die CaMKIIδ zu finden, welche die im Myokard häufigste Isoform ist (Backs et al. 2009). Ihre Aktivität wird mit pathologischer Hypertrophie und strukturellen Veränderungen in der Myokardzelle in Verbindung gebracht (siehe Einleitung).

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Das Verfahren zur Ausschaltung des Genprodukts CaMKIIδ sieht vor, Exon 1 und 2 des codierenden Gens auszuschalten bzw. herauszuschneiden. Die beiden Exons kodieren für die katalytische Domäne des Proteins und insbesondere für die ATP-Bindungsstelle. So veränderte homozygote Mäuse exprimieren das CaMKIIδ Protein nicht mehr wie mittels Western Blot – Analysen (Abbildung 2.3) nachgewiesen werden konnte (Backs et al. 2009).

Zum gezielten Entfernen der DNA-Sequenz wurde das Cre/loxP-System eingesetzt (Branda und Dymecki 2004). Dabei werden spezifische Enzyme der Klasse der Rekombinasen benutzt, die den DNA-Abschnitt zwischen zwei zuvor gezielt gesetzten loxP-Sequenzen, die in gleicher Richtung orientiert den Abschnitt mit Exon 1 und Exon 2 flankieren, herausschneiden und die beiden verbleibenden loxP-Enden zusammenfügen (Abbildung 2.2).

Bei dem angewandten Verfahren ist hervorzuheben, dass der Neomycin-Resistenzfaktor, der benutzt worden ist, um einen Selektionsvorteil zu bieten, dabei ebenfalls herausgeschnitten wurde und das Null-Allel diesen nicht mehr enthält.

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Abb. 2.2:Gene Targeting der CaMKIIδ-Knockout-Maus

Abb. 2.3:Western Blot-Analysen. Die homozygoten Knockout-Mäuse exprimieren nicht die CaMKIIδc

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Bei der Knockout-Form der gp91^phox-Mäusen handelt es sich um Mäuse, welche die katalytische Einheit gp91^phox der NADPH-Oxidase Typ 2 (Nox2) nicht exprimieren. Das entsprechende Gen dafür ist auf dem X-Chromosom lokalisiert (Brockdorff et al. 1988).

Zur Ausschaltung dieses Gens fügte man mittels homologer Rekombination das Gen für die Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase so ein, dass es zusammen mit einem neo-Gen den DNA-Abschnitt um Exon 2 und Exon 3 flankiert (Abbildung 2.4) Das Genprodukt eines so mutierten Allels ist dann nicht mehr funktional (Pollock et al.

1995). Anhand der Immunoblotanalyse kann man sehen, dass die mutierten gp91^phox -Allele nicht zur Expression funktionstüchtiger gp91phox Proteine führen, weder in der Membran noch in der gesamten Zelle (Abbildung 2.5).

Abb. 2.4: Gene Targeting der gp91^phox-Knockout-Maus. Exons sind durchnummeriert, und teilweise abgrenzend angedeuted (RI, EcoRI; X, Xbal; N, Ncol).” Der Targetvektor enthält ein neo-Gen, welches in das 3. Exon eingefügt wurde, und das Gen für die Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase HSVtk (aus Pollock et al. 1995, Seite 203).

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Abb. 2.5: Immunoblotanalyse. Hierbei wird vergleichend zwischen Wildtyp-Mäusen (wt) und männlichen Mäusen, die hemizygot für die mutierte gp91^phox-Allele sind (X-CGD) untersucht. Ein Antikörper, der an das exprimierte Protein (als Genprodukt) bindet, wurde hier verwendet, um aufzuzeigen, dass die X-CGD-Mäuse gp91^phox nicht mehr exprimieren. c steht für ganze Zelle, m für die Membran (aus Pollock et al.

1995, Seite 204)

Alle Tierexperimente wurden der zuständigen Tierschutzbehörde in Braunschweig angezeigt (Tierversuchsanzeige für die „Tötung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken“ gemäß § 4 TierSchG, Aktenzeichen T2.08 und T14.06, Bezirksregierung Braunschweig, Anzeigender Dr. Harald Kögler) und in Übereinstimmung mit dem

„Guide for the Care an Use of Laboratory Animals“ (Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council, 1996) durchgeführt.