Die Bindung von SRC-1 und TIF-2 an den Adiponectin-Promotor ist in ERβ -/- -Mäusen

Wildtyp

Die in vitro-Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass es sich bei der negativen Beeinflussung von PPARγ durch ERβ um eine Konkurrenz um die Kofaktoren SRC-1 und TIF-2 handelt. Im Folgenden soll nun mittels Chromatin Immunopräzipitation im gonadalem Fettgewebe von ERβ

-/-- und Wildtyp-Mäusen geprüft werden, ob sich die Menge von Kofaktoren, die an den Promoter von PPARγ-Zielgenen gebunden sind, unterscheidet.

Als Zielgen wurde Adiponectin gewählt, weil Daten aus dem Tierversuch zeigen, dass ERβ^-/- -Tiere sowohl einen signifikant höheren Adiponectin-Plasmaspiegel als auch eine stärkere mRNA-Expression in gonadalem Fett als der Wildtyp aufweisen [119]. Falls tatsächlich eine Konkurrenz um SRC-1 und TIF-2 dieser Abhängigkeit zugrunde liegt, dann sollten die Promotorregionen von Adiponectin in Abwesenheit von funktionierendem ERβ stärker mit diesen Kofaktoren besetzt sein.

Die Anwendung der von uns etablierten ChIP-Methode in Fettgewebe erwies sich dabei als große Herausforderung. Der äußerst geringe Proteingehalt von Fettzellen und das geringe absolute Gewicht des aus einem einzelnen Tier gewonnenen Gewebes machten ein Pooling der verschiedenen Individuen einer Gruppe (Wildtyp bzw. Knockout) unvermeidbar. Aus diesem Grund sind quantitative statistische Auswertungen der vorgenommenen Experimente nicht möglich.

3.6.1 ChIP mit Antikörpern gegen TIF-2 und SRC-1

Von 5 Wildtyp- und 6 ERβ^-/--Mäusen, die 12 Wochen mit einer Hochfettdiät gefüttert worden waren, wurde das gonadale Fettgewebe der beiden Gruppen gepoolt, nach Protokoll lysiert und eine ChIP mit Antikörpern gegen Polymerase II (Positivkontrolle), PPARγ, SRC-1 und TIF-2 durchgeführt, außerdem auf zusätzlichem Material eine Negativkontrolle mit Antikörpern gegen FLAG und Influenza-Hämagglutinin. Als Referenz für die eingesetzte DNA-Menge dienten jeweils 0,1% der entsprechenden Probe.

3.6.1.1 DNA-Fragmentlänge

Zunächst wurde die Länge der DNA-Fragmente, die bei der Sonifikation des lysierten Gewebes entstehen, geprüft. Der Grad der Fragmentation hängt von der Dauer und Energie der Sonifikation ab, unterscheidet sich aber auch von Gewebe zu Gewebe. Eine

DNA-Ergebnisse

Fragmentlänge von 200-1000 Basenpaaren ist ideal, um einerseits einen späteren Nachweis der DNA-Sequenzen mittels PCR zu ermöglichen und gleichzeitig die Spezifität für die entsprechende Protein-Bindungsstelle nicht zu verlieren [120]. Wie Abb. 3.14 zeigt, wird dieser Bereich mit unserem Protokoll erreicht.

3.6.1.2 Kontrolle (Polymerase II / GAPDH)

Zur Kontrolle wurde anschließend eine ChIP mit Antikörpern gegen die DNA-abhängige RNA-Polymerase II durchgeführt und auf die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor der konstitutiv exprimierten GAPDH überprüft. Wie Abb. 3.15 zeigt, ist sowohl in den Wildtyp- als auch den ERβ^-/--Tieren die DNA-Proteinvernetzung und die anschließende Isolierung der DNA gelungen:

Die Sequenz des GAPDH-Promotors lässt sich nicht nur vor der ChIP (in den "total"-Proben), sondern auch in den Immunopräzipitaten nachweisen.

Abb. 3.14: DNA-Gelelektrophorese von sonifiziertem Fettgewebe.

Ergebnisse

Als Negativkontrolle zum Ausschluss unspezifischer Bindungen an Antikörper oder Beads bzw.

Verunreinigungen wurde eine ChIP mit Antikörpern gegen nicht vorhandene Zielproteine mitgeführt: Das synthetische FLAG-Tag, das üblicherweise zur Markierung von (Fusions-)-Proteinen verwendet wird, und Influenza-Hämagglutinin. Zusätzlich wurde eine ChIP in Abwesenheit von Antikörper durchgeführt. Das Ergebnis zeigt Abb. 3.16. Ersichtlich ist, dass die Menge unspezifischer DNA-Kontaminationen in allen 3 Ansätzen vernachlässigbar ist.

3.6.1.3 Bindung nukleärer Faktoren an den Adiponectin-Promotor

Zunächst wurde auch für die PCR des Adiponectin-Promotors eine Negativkontrolle durchgeführt, die keine unspezifischen DNA-Antikörperbindungen oder DNA-Kontaminationen ergab. (Abb. 3.17)

Abb. 3.15: Positivkontrolle auf GAPDH-Promotor.

ChIP mit Antikörpern gegen Polymerase II, PCR auf GAPDH-Promotor.

GAPDH wird konstitutiv transkribiert und eignet sich daher in Verbindung mit Polymerase II (notwendig für die Transkription) als Positivkontrolle. neg: Nullprobe, pos: Genomische Kontroll-DNA, WT:

Wildtyp, KO: Knockout, total: (verdünnte) DNA vor der IP, Pol II: IP mit Polymerase-II-Ak

Abb. 3.16: Negativkontrolle auf GAPDH-Promotor.

ChIP mit nicht-bindenden Antikörpern, PCR auf GAPDH-Promotor. neg:

Nullprobe, pos: Genomische Kontroll-DNA, Flag: IP mit Ak gegen FLAG-Fusionsprotein, HA: IP mit Ak gegen Influenza-Hämagglutinin, nur Beads: IP ohne Ak

Ergebnisse

Wie eine ChIP mit Antikörpern gegen PPARγ zeigt, gibt es keinen deutlichen Unterschied zwischen ERβ^-/-- und Wildtyp-Tieren in der Bindung von PPARγ an den Adiponectin-Promotor (Abb. 3.18). Es ist bekannt, dass das PPARγ-RXR-Dimer auch in inaktiver Konformation an DNA gebunden sein kann und in diesem Zustand Korepressoren rekrutiert [66]. Eine Differenz in der PPARγ-Bindung an den Adiponectin-Promotor wäre also nicht zu erwarten gewesen, die unterschiedliche PPARγ-Aktivität muss durch Faktoren bedingt werden, die weiter

„downstream“ in der Transkriptions-Initiation liegen.

Tatsächlich wird sowohl SRC-1 (Abb. 3.19) als auch vor allem TIF-2 (Abb. 3.20) in den ERβ^-/- -Tieren gegenüber dem Wildtyp deutlich verstärkt an den Adiponectin-Promotor angelagert.

Während die eingesetzte DNA-Menge in beiden ChIPs ("total") gleich ist, ist nach Immunopräzipitation im Fettgewebe der Knockout-Tiere das Signal der Adiponectin-Promotor-Sequenz deutlich stärker als im Wildtyp.

Abb. 3.17: ChIP FLAG-Ak / Adiponectin.

ChIP in gonadalem Fett von Wildtyp- (WT) und ERβ^-/- (KO) -Mäusen. Antikörper gegen FLAG-Fusionsprotein zum Ausschluss unspezifischer Kontamination mit Adiponectin-DNA, PCR auf Adiponectin-Promotor. neg: Nullprobe, pos:

Genomische Kontroll-DNA, WT: Wildtyp, KO: Knockout, total: (verdünnte) DNA vor der IP, Flag: IP mit FLAG-Ak

Abb. 3.18: ChIP PPARγ-Ak / Adiponectin.

ChIP in gonadalem Fett von Wildtyp- (WT) und ERβ^-/- (KO) -Mäusen. Antikörper gegen PPARγ, PCR auf Adiponectin-Promotor. neg: Nullprobe, pos: Genomische Kontroll-DNA, WT: Wildtyp, KO: Knockout, total: (verdünnte) DNA vor der IP, PPARγ: IP mit PPARγ-Ak.

Ergebnisse

Es zeigt sich also, dass durch Ausschaltung von ERβ in vivo die Kofaktoren SRC-1 und TIF-2 stärker an PPARγ und damit mittelbar an den Adiponectin-Promotor rekrutiert werden. Diese Beobachtung bestätigt die zuvor in vitro gewonnenen Ergebnisse und demonstriert so die Relevanz der Kofaktoren-Konkurrenz in einem physiologischen System.

Abb. 3.19: ChIP SRC-1-Ak / Adiponectin.

ChIP in gonadalem Fett von Wildtyp- (WT) und ERβ^-/- (KO) -Mäusen. Antikörper gegen SRC-1, PCR auf Adiponectin-Promotor. neg: Nullprobe, pos: Genomische Kontroll-DNA, WT: Wildtyp, KO: Knockout, total: (verdünnte) DNA vor der IP, PPARγ: IP mit SRC-1-Ak.

Abb. 3.20: ChIP TIF-2-Ak / Adiponectin.

ChIP in gonadalem Fett von Wildtyp- (WT) und ERβ^-/- (KO) -Mäusen. Antikörper gegen TIF-2, PCR auf Adiponectin-Promotor. neg: Nullprobe, pos: Genomische Kontroll-DNA, WT: Wildtyp, KO: Knockout, total: (verdünnte) DNA vor der IP, PPARγ: IP mit TIF-2-Ak.

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