Die Bedeutung der Kalzium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase IIδ c

Arrhythmien

Bei den Kalzium/Calmodulin-Kinasen handelt es sich um eine Gruppe multifunktioneller Serin/Threonin-Proteinkinasen, die ubiquitär vorkommen und nach Aktivierung durch kalziumgebundenes Calmodulin diverse intrazelluläre Zielproteine phosphorylieren (Braun und Schulman 1995). Es existieren verschiedene Isoformen und Subtypen, von denen die CaMKIIδ die vorherrschende Variante im Kardiomyozyten darstellt (Jett et al. 1987). Von dieser sind die Splicevarianten δb und δc bekannt, wobei sich die CaMKIIδb strukturell lediglich durch eine elf Aminosäuren lange Kernlokalisationssequenz von der CaMKIIδc

unterscheidet, die dazu führt, dass sie ausschließlich intranukleär vorkommt (Zhang und Brown 2004). Entsprechend übt diese nukleäre Form ausschließlich Einflüsse auf die Genexpression der Herzmuskelzelle aus, wohingegen die zytosolische CaMKIIδc, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit überexprimiert wurde, zusätzlich maßgeblich an der Regulation des myozytären Kalziumstoffwechsels (Zhang et al. 2007; siehe unten) und nach neueren Untersuchungen auch an der Regulation anderer Ionentransportsysteme (Natriumkanäle, I_to; Wagner et al. 2006, Wagner et al. 2009; siehe unten)beteiligt ist.

1.3.3.1 Struktur und Aktivierung der CaMKIIδc

Bei der CaMKIIδc handelt es sich um ein Holoenzym, das aus 6-12 Untereinheiten aufgebaut ist, die in einer Ringstruktur angeordnet sind (siehe Abbildung 1.5). Jede dieser Untereinheiten besteht aus drei unterschiedlichen Domänen: einer katalytischen Domäne, einer (auto-)regulatorischen Domäne und einer Assoziationsdomäne, die die Oligomerisierung der Kinase bewirkt. Die (auto-)regulatorische Domäne beinhaltet ein autoinhibitorisches Segment. Durch Bindung von Kalzium/Calmodulin an dieses inhibitorische Segment kommt es zu einer Konformationsänderung die dazu führt, dass das aktive Zentrum der katalytischen Domäne Zugang zu den Zielproteinen bekommt. Ein derart aktiviertes CaMKII-Monomer kann seinerseits benachbarte Monomere durch Phosphorylierung im Bereich der autoregulatorischen Domäne aktivieren. Dadurch kann die Enzymaktivität im Sinne eines Gedächtnisses auch noch nach Abfall der Kalziumkonzentration und somit nach Beendigung der Kalzium/Calmodulin-Wirkung weitgehend erhalten bleiben (Maier und Bers 2002).

Abbildung 1.5: Struktur und Aktivierung der CaMKII. Im oberen Teil der Abbildung sind die drei Domänen des CaMKII-Monomers dargestellt. 6-12 dieser Monomere (hier 6) verbinden sich radförmig und bilden das komplette CaMKII-Holoenzym. Durch Bindung von Kalzium/Calmodulin an die regulatorische Domäne kommt es zu einer Konformationsänderung und nachfolgender Aktivierung der CaMKII. Im unteren und mittleren rechten Bild ist die Autophosphorylierung durch Nachbarmonomere dargestellt, die an Thr-286 erfolgt und dazu führt, dass die CaMKII auch nach Abdissoziation von Calmodulin 20-80% ihrer Aktivität behalten kann. (Aus Maier und Bers 2002, S. 924)

1.3.3.2 Einfluss der CaMKIIδc auf die Genexpression des Kardiomyozyten

Obwohl die zytosolische Isoform der Kalzium/Calmodulin abhängigen Proteinkinase IIδnicht im Zellkern vorkommt, übt sie dennoch Einflüsse auf die Genexpression des Kardiomyozyten aus. So konnte gezeigt werden, dass es durch Überexpression der CaMKIIδc zu einem veränderten Genexpressionsmuster und konsekutiver Hypertrophie kommt (Zhang et al. 2003, Maier et al. 2003, Zhang et al. 2007). Der vermutete Mechanismus hierfür ist in Abbildung 1.6 dargestellt und erläutert.

Abbildung 1.6: Einfluss der CaMKIIδc auf die Genexpression der Herzmuskelzelle. Möglicherweise bewirkt die zytosolische Phosphorylierung des HDAC4/14-3-3-Komplexes durch die CaMKIIδc, dass dieses nicht zurück in den Zellkern gelangen kann. Dadurch entfallen dessen hemmende Einflüsse auf die Expression verschiedender nachgeschalteter Transkriptionsfaktoren, wodurch es letztlich zur Induktion von Hypertrophiegenen kommt. (Modifiziert nach Zhang et al. 2007, S. 35085)

1.3.3.3 Einfluss der CaMKIIδc auf den Ionenfluss und insbesondere den Kalziumstoffwechsel des Kardiomyozyten

Durch Phosphorylierung verschiedener Zielproteine übt die CaMKIIδc eine Vielzahl von Einflüssen auf den kardiomyozytären Kalziumstoffwechsel aus. So phosphoryliert sie den spannungsabhängigen Kalziumkanal und bewirkt so eine Verstärkung des L-Typ-Kalziumeinstroms (Anderson et al. 1994, Yuan und Bers 1994, Maier et al. 2003) und über den Mechanismus der kalziuminduzierten Kalziumfreisetzung (siehe Abschnitt 1.2.2) auch des Kalziumausstroms aus dem SR. Darüber hinaus wird die SR-Kalziumfreisetzung aber auch durch direkte Phosphorylierung des kardialen Ryanodinrezeptors (RyR2) an Ser-2809 (Witcher et al. 1991) (bzw. speziesabhängig auch Ser-2808) und/oder Ser-2814/15 (Huke und

Bers 2008, Wehrens et al. 2004) verstärkt. Dies bewirkt eine Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit des RyR (Wehrens et al. 2004) und somit eine Verstärkung der SR-Kalziumfreisetzung während der Elektromechanischen Kopplung. Pathophysiologisch bedeutsamer scheint aber vor allem eine Erhöhung der Frequenz diastolischer SR-Kalziumfreisetzungsereignisse (Maier et al. 2003) zu sein, da es zu einem so genannten Kalzium Leck aus dem SR kommt.

Auch an der Regulation der Kalziumaufnahme in das SR ist die CaMKIIδc beteiligt. So phosphoryliert sie Phospholamban (PLB) an Threonin-17, was dazu führt, dass dieses von der SERCA abdissoziiert und seine inhibitorische Wirkung verliert (LePeuch et al. 1979, Davis et al. 1983). Darüber hinaus wird auch eine Aktivierung der SERCA durch direkte Phosphorylierung durch die CaMKIIδc diskutiert (Xu et al. 1993, Toyofuku et al. 1994, Desantiago et al. 2002). Insgesamt scheint aber der Einfluss auf den Ryanodinrezeptor und somit auf den Kalziumverlust aus dem SR gegenüber dem Einfluss auf die Kalziumaufnahme in das SR zu überwiegen, so dass es durch die CaMKIIδ_c zu einer Verminderung des sarkoplasmatischen Kalziumgehaltes kommt (Maier et al. 2003).

Nach neueren Befunden hat die CaMKIIδc darüber hinaus auch direkten Einfluss auf andere Ionentransportssysteme wie die kardialen Natriumkanäle (Wagner et al. 2006) sowie Kaliumkanäle, die für den transienten Auswärtsstrom (I_to) verantwortlich sind (Wagner et al.

2009, Tessier et al. 1999).

1.3.3.4 CaMKIIδc, Herzinsuffizienz- und Arrhythmieentstehung

Schon 1999 konnten Kirchhefer et al. zeigen, dass am insuffizienten menschlichen Myokard erhöhte Aktivitätslevel der CaMKIIδc auftreten. Da diese positiv mit der hämodynamischen Funktion der Herzen (gemessen als LV-EF und CI) korrelierten, vermuteten die Autoren zunächst, dass es sich dabei um einen Kompensationsmechanismus handelt.

Da bereits bekannt war, dass die CaMKIIδc Phospholamban phosphoryliert (siehe Abschnitt 1.3.3.3), vermuteten sie, dass durch die verstärkte diastolische SR-Kalziumaufnahme die Relaxation verbessert werde. Des Weiteren war bereits bekannt, dass die CaMKII auch den kardialen RyR phosphoryliert (siehe Abschnitt 1.3.3.3). Daher spekulierte die Gruppe um Kirchhefer, dass durch Erhöhung der RyR-Offenwahrscheinlichkeit in der Systole vermehrt Kalzium zur Verfügung gestellt werde und so die Kontraktilität verbessert werde.

Doch 2003 konnten Maier et al. und Zhang et al. im gleichen transgenen Mausmodell zeigen, dass eine erhöhte CaMKIIδ_c–Aktivität Hypertrophie und Herzinsuffizienz verursacht. So fanden diese Autorengruppen bei Mäusen die eine dreifache Überexpression der CaMKIIδc

aufwiesen eine Verdopplung des Verhältnisses von Herz- zu Körpergewicht, sowie eine Verdopplung des Myozytenvolumens im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auf mRNA-Ebene wiesen Zhang et al. ein verändertes Genexpressionsmuster mit vermehrter Expression typischer Hypertrophiemarker (ANF, β-MHC, u.a.) in den CaMKII-überexprimierenden Kardiomyozyten nach. Sowohl echokardiographisch (Zhang et al. 2003) als auch auf zellulärer Ebene (Maier et al. 2003) fand sich eine signifikante Reduktion der Kontraktilität, die auf eine Verminderung des SR-Kalziumgehaltes zurückgeführt werden konnte. Letztere basiert auf einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit des RyR und somit einer Erhöhung der Frequenz diastolischer SR-Kalziumfreisetzungsereignisse (Maier et al. 2003).

Über den NCX, dessen Funktion um 30% gesteigert ist (Maier et al. 2003), wird dieses diastolisch freigesetzte Kalzium eliminiert und steht somit nicht mehr für die nachfolgende Kontraktion zur Verfügung. Ferner kann es zur Entstehung von DADs und so zur Arrhythmogenese beitragen (vgl. Abschnitt 1.3.2).

Des Weiteren zeigten Maier et al., dass die Kalziumaufnahme in das SR bei CaMKIIδ_c -Überexpression ebenfalls reduziert ist, obwohl die oben beschriebene Phosphorylierung von PLB zum Wegfall der SERCA-Inhibition führt.

Diesen funktionellen Befund konnten die Autoren durch das veränderte Proteinexpressionsmuster der CaMKIIδc-überexprimierenden Kardiomyozyten erklären: Sie fanden eine verminderte Expression von SERCA und PLB, wobei jedoch die Verminderung der PLB-Expression weniger ausgeprägt war, so dass daraus insgesamt eine stärkere Inhibition der SERCA mit einer leichten Reduktion der Funktion resultierte. Dies entspricht dem typischen Proteinmuster bei Herzinsuffizienz. Abbildung 1.7 fasst die vielfältigen Phosphorylierungsstellen sowie Wirkungen der Kalzium-Calmodulin abhängigen Proteinkinase IIδc in der Herzmuskelzelle zusammen.

P Phosphorylierungsstellen der CaMKIIδc in der Herzmuskelzellean. Im Schaubild rot geschriebene Proteine werden bei Herzinsuffizienz vermindert, blau geschriebene Proteine vermehrt exprimiert. Die grün gestrichelten Pfeile zeigen die funktionellen Auswirkungen der CaMKIIδc an.

(Modifiziert nach Maier und Bers 2007, S. 632, Bers 2001, S. 322, Zhang et al. 2003, S. 915)

1.4 FKBP, die D37S-Mutante und der kardiale Ryanodinrezeptor