4.1.1 Fragestellung und experimentelles Vorgehen
Die Fragestellung des ersten Teils dieser Arbeit war, ob die Expression von BACE1 in Modellen der Demyelinisierung verändert ist. Im Lichte der Berichte über die Rolle von BACE1 bei der Myelinisierung im Peripheren und Zentralen Nervensys-tem (Hu et al. 2006; Willem et al. 2006) erschien dies als realistischer Vorgang.
Dazu wurden bereits in der Arbeitsgruppe vorliegende Lysate freipräparierter Hirnstämme von Ratten, bei denen eine EAE induziert worden war, sowie von Ge-hirnen von Mäusen, die mit Cuprizone behandelt worden waren, mittels Western-blot analysiert.
4.1.2 BACE1-Expression in Zellpopulationen des ZNS
Um für Aussagen über mögliche Quellen von BACE1 in den Gewebslysaten auf eige-ne Dateien zurückgreifen zu köneige-nen und den zur Verfügung stehenden Antikörper gegen BACE1 weiter im Westernblot zu charakterisieren, wurde zunächst die Ex-pression von BACE1 in Zellpopulationen des ZNS untersucht. Dazu wurden Lysate von Maus-Primärzellkulturen der verschiedenen Populationen erstellt. Die Kultu-ren wurden von Mitgliedern der Arbeitsgruppe zur Verfügung gestellt. Als Positiv-kontrolle diente ein Gehirnlysat einer Ratte, als Referenzprotein wurde Aktin ver-wendet. Verglichen wurde der Gehalt an BACE1 in hippokampalen und kortikalen Neuronen, in Oligodendrozyten, in Astrozyten und in Mikroglia. Dabei zeigten sich die höchsten BACE1-Level in Neuronen. Doch auch in Oligodendrozyten ließen sich größere Mengen an BACE1 nachweisen. Astrozyten und Mikroglia wiesen nur Spu-ren von BACE1 auf. Die Quantifizierung von BACE1 gegen Aktin ergab ein Verhält-nis von 2,53 in hippokampalen und von 5,34 in kortikalen Neuronen, von 0,99 in
Ergebnisse 51 Oligodendrozyten, von 0,04 in Astrozyten und von 0,02 in Mikroglia (vgl. Abbil-dung 4.1 und AbbilAbbil-dung 4.2).
Abbildung 4.1: BACE1-Verteilung in Zellpopulationen des ZNS. Als Positivkontrolle diente ein Gehirnlysat. Ge-hirnlysat einer Ratte, murine Primärzellkulturen. BACE1 lässt sich in allen neuronalen Zellen nachweisen. Hip-poN = hippokampale Neurone, KorN = kortikale Neurone. Oligo = Oligodendrozyten.
Abbildung 4.2: BACE1-Verteilung in Zellpopulationen des ZNS. Quantifizierung des Westernblots von Abbildung 4.1 Gehirnlysat einer Ratte, murine Primärzellkulturen. HippoN = hippokampale Neurone, KorN = kortikale Neurone.
4.1.3 BACE1-Expression in Modellen der Demyelinisierung
Die Untersuchung der BACE1-Expression in Gehirnlysaten von mit Cuprizone be-handelten Mäusen liefert eine erste Annäherung an die Frage, ob BACE1 im Rah-men der De- und Remyelinisierung eine Rolle spielt. Dabei steht im Cuprizonemo-dell vor allem die toxische Komponente im Vordergrund: Oligodendroyten als Mye-linbildner des ZNS werden durch den Kupferchelator Cuprizone in die Apoptose getrieben. Eine umfangreiche Demyelinisierung ist die Folge, die sich nach Abset-zen von Cuprizone zurückbildet (Matsushima 2001). Analysiert wurden vier unbe-handelte Mäuse als Kontrolle sowie fünf mit Cuprizone beunbe-handelte Tiere. Als Refe-renzprotein diente Calnexin. Die Quantifizierung zeigte dabei durchschnittlich eine Halbierung des Gehalts an BACE1 in mit Cuprizone behandelten Tieren im Ver-gleich zur Kontrollgruppe (BACE1-Calnexin-Quotient von 0,52 in der Kontrollgrup-pe zu 0,25 in der CuprizonegrupKontrollgrup-pe, vgl. Abbildung 4.3 und Abbildung 4.4). Diese Ergebnisse zeigten jedoch keine statistische Signifikanz (P = 0,12).
Abbildung 4.3: BACE1-Expression in Gehirnlysaten von Mäusen nach Cuprizonebehandlung.
Ergebnisse 53
Um Daten aus einem anderen Aspekt der Demyelinisierung zu erhalten, wurden die freipräparierten Hirnstämme von Ratten, bei denen eine EAE induziert worden war, untersucht. In diesem Modell steht die autoimmune Reaktion im Vordergrund.
Im Vergleich mit dem Cuprizonemodell ließen sich so Schlüsse auf die Rolle von BACE1 bei verschiedenen Formen der Demyelinisierung ziehen. Analysiert wurden je vier unbehandelte Tiere als Kontrolle mit vier EAE-Tieren. Als Referenzprotein diente wieder Calnexin. Die Quantifizierung zeigte dabei durchschnittlich eine Ver-dopplung des Gehalts an BACE1 in behandelten Tieren im Vergleich zur Kontroll-gruppe (BACE1-Calnexin-Quotient von 0,46 in der KontrollKontroll-gruppe zu 1,24 in der EAE-Gruppe, vgl. Abbildung 4.5 und Abbildung 4.6). Auch diese Ergebnisse zeigten keine statistische Signifikanz (P = 0,089).
Abbildung 4.4: BACE1-Expression in Gehirnlysaten von Mäusen nach Cuprizonebehandlung. Quantifizierung des Westernblots von Abbildung 4.3. Fehlerbalken zeigt SEM (standard error of the mean).
4.1.4 BACE1-Expression im Rahmen von Inflammation
Da gerade die Daten der EAE-Ratten einen robusten Trend zur vermehrten Expres-sion von BACE1 im Zusammenhang mit Inflammation erkennen ließen und Mikrog-liazellen eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von MS- und EAE-Läsionen spielen (Gold et al. 2006), lag die Hypothese nahe, dass diese Zellpopulation zur BACE1-Vermehrung in der EAE beiträgt. Somit sollten proinflammatorische
Fakto-Abbildung 4.5: BACE1-Expression in Hirnstammlysaten von Ratten nach Induktion einer EAE.
Abbildung 4.6: BACE1-Expression in Hirnstammlysaten von Ratten nach Induktion einer EAE. Quantifizierung des Westernblots von Abbildung 4.5. Fehlerbalken zeigt SEM.
Ergebnisse 55 ren eine Erhöhung der BACE1-Expression in Mikroglia bewirken. Als Modell wur-den EOC-20-Zellen (ATCC-Nummer CRL-2469), eine immortalisierte Zellinie von Mikroglia aus dem Mausstamm C3H/HeJ, verwendet. Diese Zellen wurden für 24h mit Liganden von toll-like-Rezeptoren und proinflammatorischen Chemokinen sti-muliert und anschließend ihr Gehalt an BACE1 gemessen. Als Referenzprotein diente Aktin. Dabei zeigte sich bereits in den unbehandelten Kontrollzellen ein niedriger BACE1-Level. In den mit CpG, einem Liganden des TLR 9, stimulierten Zellen zeigte sich eine deutliche Zunahme der BACE1-Expression. Keinen Einfluss auf BACE1 hatten Lipopolysaccharide (LPS) als Liganden von TLR 4, und Rantes, ein Chemokin. Die Quantifizierung zeigte dabei für die unbehandelten Kontrollzel-len einen niedrigen Wert von 0,22. Vergleichbare Werte von 0,23 und 0,21 wiesen die mit LPS und mit Rantes behandelten Zellen auf. Eine Verdoppelung auf 0,45 zeigten die mit CpG behandelten Zellen. Das Macrophage Inflammatory Protein 1α (MIP-1α), ein Chemokin, führte zu einer Zunahme um etwa die Hälfte auf 0,33 (vgl.
Abbildung 4.7 und Abbildung 4.8).
Abbildung 4.7: BACE1-Expression in EOC-Zellen nach Stimulation durch Liganden von toll-like-Rezeptoren und Chemokinen.