Für die Diagnostik einer invasiven Candidiasis standen mikrobiologische sowie histopathologische Befunde zur Verfügung. Für die Studie wurden die Befunde ausgewertet, die ausgehend vom Stichtag für die nächsten 30 Tage erhoben wurden.
Im Folgenden werden die etablierten diagnostischen Methoden der Charité – Universitätsmedizin Berlin, am Standort Benjamin Franklin beschrieben. Während des Beobachtungszeitraums standen keine molekularbiologischen Methoden wie Antigen-Antikörpertest oder der Nachweis von 1-3 beta-D-Glucan zur Verfügung. Auch fand das Verfahren der Polymerasekettenreaktion bislang keine regelhafte Anwendung.
22 Mikrobiologische Befunde
2.3.1.1 Blutkulturen
Am Campus Benjamin Franklin der Charité - Universitätsmedizin Berlin wird das Blutkultursystem BACTEC® verwendet. Als Standardnährmedien dienen Columbia Blutagar, welcher als das am häufigsten verwendete Erstisolierungs-Medium in vielen europäischen Ländern Anwendung findet (84), außerdem die Weiterentwicklung CNA-Blutagar, welcher mit Colistin und Nalidixinsäure zur selektiven Isolierung grampositiver Bakterien angereichert ist (85), des Weiteren der mit Gallensalzen versetzte MacConkey- Agar, der der Isolierung von Enterobacteriaceae und anderen gram-negativen Stäbchen dient (86), sowie Kochblutagar für die Isolierung anspruchsvoller Organismen (87).
Blutkulturen wurden als aerobe und anaerobe Pärchen abgenommen. Die Bebrütungsdauer der Blutkulturflaschen beträgt fünf Tage. Als spezielles Nährmedium für Pilzkulturen wird Sabouraud-Agar eingesetzt, der durch den hohen Anteil an Glucose und den niedrigen pH-Wert vorteilhaft für das Wachstum von Pilzen ist (88). Hier liegt die Bebrütungsdauer bei 14 Tagen. Im Klinikstandard war bislang der Gebrauch spezieller Nährmedien für Pilzkulturen nicht regelhaft etabliert. Die Speziesidentifizierung erfolgte routinemäßig mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie (89). Zudem erfolgte die Differenzierung auch mikroskopisch anhand morphologischer Kriterien sowie aufgrund spezieller biochemischer Eigenschaften. Die Grenzwerte bezüglich der Empfindlichkeit einzelner Spezies lehnen sich an die Empfehlungen des „European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing“ (EUCAST) an.
Im Rahmen der Studie wurde erfasst, ob Blutkulturen zum ZP 1, eingeschlossen 24 Stunden vor oder nach diesem Stichtag, abgenommen wurden. Im Gegensatz zu den intraabdominellen Abstrichen sowie den histopathologischen Probeentnahmen bedarf eine Blutkulturentnahme keiner invasiven Maßnahme. So wurde auch die Abnahme von Blutkulturen unabhängig von einem operativen Eingriff im gesamten Beobachtungszeitraum erfasst. Zudem wurde die Gesamtzahl der abgenommenen Blutkulturpärchen pro Patient im Beobachtungszeitraum von 30 Tagen erhoben. Trat eine positive Blutkultur auf, so wurde anhand des zeitlichen Abstandes zum Auftreten der Anastomoseninsuffizienz, sowie dem klinischen Zustand des Patienten und dem gleichzeitigen Vorhandensein einer positiven Pilz-Diagnostik zwischen einer primären, katheterassoziierten Candidämie und einer sekundären Candidämie abdominellen Ursprungs unterschieden.
23 2.3.1.2 Abdominelle Abstriche
Im Rahmen der Studie wurden ausschließlich intraoperativ gewonnene, sterile Abstriche ausgewertet. Oberflächliche Wundabstriche oder Drainagesekret wurden nicht berücksichtigt. Nach aktuellem Klinikstandard erfolgte keine routinemäßige Abnahme von Abstrichen an verschiedenen Lokalisationen zur Ermittlung einer Candida-Kolonisation.
Die im Rahmen einer abdominellen OP gewonnenen Abstriche wurden in einem geeignetem Entnahme- und Transportröhrchen (eSwab™) eingeschickt. Es erfolgte die Anzüchtung auf Chromagar, Sabouraud-Glucose-Agar oder in Sabouraud-Bouillon zur Kultivierung von Hefen oder Schimmelpilzen (90, 91) und eine sieben tägige Bebrütung.
Die Speziesidentifizierung wurde parallel zum Verfahren bei Blutkulturen mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie durchgeführt.
Im Rahmen der Studie wurden alle intraoperativen Abstriche innerhalb des Beobachtungszeitraums von 30 Tagen nach der Diagnose einer Anastomoseninsuffizienz eingeschlossen. Zudem wurde nach Speziesdifferenzierung der Candida-Stamm dokumentiert. Es wurden außerdem die Gesamtanzahl der gewonnenen Abstriche, sowie der zeitliche Zusammenhang der Abstriche zur Operation im Rahmen der Anastomoseninsuffizienz, bzw. einer folgenden Revision hergestellt.
Anhand der intraabdominellen Abstriche wurde auch der kulturelle Nachweis von Bakterien ermittelt. Jeder Erreger wurde pro Patient nur einmal gezählt. Zugunsten einer übersichtlichen Darstellung wurden die nachgewiesenen Bakterien gruppiert und in folgende Blöcke zusammengefasst:
- Gramnegative Enterobakterien: Citrobacter spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Hafnia alvei, Klebsiella spp., Morganella spp., Pantoea species, Proteus mirabilis, Serratia marcescens
- Enterokokken: Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Enterococcus rafinosus
- Anaerobier: Bacteroides spp., Fusobacterium nucleatum, Parabacteroides distasonis, Peptoniphilus asaccharolyticus, Prevotella spp., Propionibacterium, Veillonella parvula
- Streptokokken
- Staphylokokken: inkl. Staphylococcus aureus - Pseudomonas aerugenosa
24 - sonstige: Bacillus cereus, Comamonas testosteronie, Corynebacterium tuberculosteaticum, Gemella haemolysnas, Geotrichum candidum, Lactobacillus spp., Neisseria subflava, Stenotrophomonas maltophilia
Histopathologische Befunde
Es wurde ermittelt, ob bei der Operation im Rahmen der Anastomoseninsuffizienz oder bei einem folgenden Revisionseingriff eine histopathologische Probe entnommen wurde.
Erfolgte eine intraoperative Abnahme und die anschließende Aufarbeitung durch die Pathologie, wurde zwischen folgenden vier Kategorien hinsichtlich der Diagnostik einer invasiven Candidiasis unterschieden:
1. Material an Pathologie gesendet, allerdings ungeeignet zur Beurteilung einer Pilzbesiedlung (z. B. Probeexzision des Magens, unabhängig der
Anastomoseninsuffizienz).
2. Nachuntersuchung des Präparates im Rahmen der Studie durch Pathologen, da bislang bei dem eingegangen Präparat keine Stellung bezüglich einer Pilzbesiedlung vorgenommen wurde.
3. Einsendung der Probe ohne explizite Anforderung einer Pilz-Diagnostik seitens der Chirurgie. Der Pathologe nahm dennoch Stellung zu einer möglichen Pilzbesiedlung.
4. Explizite Fragestellung nach Pilzbesiedlung im Rahmen einer Pilz-Probe (Pilz-PE).
Wurden bei einer Operation mehrere Proben unterschiedlicher „Kategorien“ hinsichtlich der Qualität einer Pilz-Diagnostik eingeschickt, so wurde in die Probe in die Studie aufgenommen, die für eine Pilz-Diagnostik am geeignetsten war.
Alle Proben wurden makroskopisch von einem Pathologen untersucht. Hierfür wurde das Gewebe in Formalin fixiert und in Paraffin gebettet. Es erfolgte eine Standardfärbung mit Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung). Zudem wurde eine histologische Untersuchung durchgeführt, die von insgesamt zwei Pathologen vorgenommen wurde. Proben, die als Pilz-PE eingeschickt wurden (Kategorie 4), wurden grundsätzlich mit Perjodsäure gefärbt (Perjodsäure-Schiff-Färbung). Zur besseren Darstellung der Pilzbestandteile wurde ggf.
eine Versilberung mittels Grocott-Färbung ergänzt. Diese Spezialfärbungen wurden auch durchgeführt, wenn seitens des Pathologen der Verdacht auf eine Pilzbesiedlung bestand, selbst wenn der Einsender des Präparats nicht explizit eine Pilzdiagnostik angefordert hatte (Kategorie 3). Im Rahmen der Studie wurden alle Befunde durch einen weiteren Pathologen erneut gesichtet. Lagen Präparate vor, die für eine Pilzdiagnostik
25 geeignet waren, aber bislang keine Stellung zu einer möglichen Pilzbesiedlung genommen wurde, wurden diese Präparate erneut mit der Fragestellung einer invasiven Candidiasis von einem Pathologen gesichtet und falls erforderlich, wurde eine Spezialfärbung ergänzt. Es erfolgte anschließend eine erneute Befundung (Kategorie 2).
Eine Pilz-Probe wurde „Pilz positiv“ bewertet, falls Pilze überhaupt und unabhängig von der aufgetretenen Anzahl im eingesandten Material nachgewiesen wurden. Die Beschreibung des Pathologen erfolgte deskriptiv. Je nach Beschaffenheit der Probe konnte entweder lediglich eine Aussage über das Vorhandensein von Pilzen oder aber auch über infiltratives Wachstum getroffen werden. Es erfolgte keine Speziesdifferenzierung anhand des histologischen Präparates.