Globale Gesundheitskrisen wie die COVID-19-Pandemie zeigen deutlich den Bedarf an neuartigen und besseren diagnostischen und therapeutischen Instrumenten. Darüber
1.2. Deutsch dender Bedeutung. Existierende Methoden haben jedoch in einigen Bereichen Defizite, insbesondere im Hinblick auf die Spezifität und das Auflösungsvermögen der Detektion sowie den zielgerichteten Transport von Medikamenten.
Einwandige Kohlenstoffnanoröhren (single-walled carbon nanotubes, SWCNTs) sind reine Kohlenstoff-Nanopartikel, die das Potenzial haben, diese Herausforderungen zu bewälti-gen. Sie emittieren Licht im nahen Infrarot (NIR,>900 nm), was zu drei deutlichen Vor-teilen führt. Erstens kann NIR-Strahlung für verbessertein vivo-Fluoreszenz-Bildgebung mit reduziertem Hintergrund und tieferer Gewebepenetration verwendet werden. Zwei-tens ist die NIR-Fluoreszenz der SWCNTs nicht-bleichender sowie nicht-blinkender Na-tur, welches wiederum längere Beobachtungsdauern von mehreren Stunden oder Tagen erlaubt. Drittens ist die NIR-Fluoreszenz von SWCNTs abhängig von ihrer chemischen Umgebung. Dies führt in Zusammenhang mit der großen Oberfläche dazu, dass Kohlen-stoffnanoröhren als hochsensitive optische Sensoren zum Beispiel für die Biomarkerde-tektion verwendet werden können. Diese vorteilhaften Eigenschaften können jedoch nur ihre Anwendung finden, wenn es gelingt, die einzig aus Kohlenstoffatomen bestehende Oberfläche so weit chemisch zu verändern, dass sie die selektive Erkennung z.B. von Bio-markern oder das Anvisieren von z.B. zellulären Rezeptoren ermöglicht.
Zu diesem Zweck stellt diese Arbeit neue Strategien vor, mit denen kohlenstoffnanoröh-renbasierte Biosensoren generiert werden können. In einem ersten Schritt wurden Sen-soren für den Neurotransmitter Dopamin hinsichtlich ihrer Sensitivität und Selektivität charakterisiert und optimiert. EinScreeningvon unterschiedlichen DNA-Sequenzen, wel-che auf der Nanoröhrenoberfläwel-che adsorbieren, führte zu unterschiedliwel-chen Kd-Werten (2.3 nM - 9.4µM) sowie zu speziellen DNA-Sequenzen, welche es erlauben, Dopamin in Gegenwart des strukturell ähnlichen Neurotransmitters Noradrenalin zu detektieren.
In einem nächsten Schritt wurde nun dieser Dopaminsensor mit kleinen Antikörperfrag-menten (Nanobodies) dekoriert, welche es vermögen, ihr Antigen mit hoher Spezifität zu binden. Diese neuen zielgerichteten Sensoren wurden nicht nur umfassendin vitro cha-rakterisiert, sondern auchin vivoin Drosophilaembryonen angewandt, um dort den Spin-delapparat mittels NIR-Immunfluoreszenzmikroskopie in tiefen Gewebeschichten unter-suchen zu können. Ferner erlaubte es diese neue Technik, zum ersten Mal ein sich be-wegendes Kinesin-Motorprotein in einem lebenden Organismus zu verfolgen und somit ein vertieftes Verständnis wichtiger intrazellulärer Prozesse zu erlangen (wie z.B. die Ge-schwindigkeit, mit der sich ein Motorproteinin vivobewegt,v = 610±330 nm s-1).
Darüber hinaus wurden neben DNA-Oligonukleotiden auch Peptidfässer als neuartige
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1. Abstract
Oberflächenmodifikation von SWCNTs eingeführt. Diese de novo erstellten Peptidfässer bieten nicht nur eine höhere Sequenzvariabilität im Vergleich zu Nukleinsäuren, son-dern ebenfalls die Möglichkeit, bestimmte SWCNT-Chiralitäten anzureichern. Außerdem haben sie das Potenzial zur Anwendung als Funktionalisierungsplattform mit der Mög-lichkeit, funktionale Einheiten wie Fluorophore, Medikamente oder Antikörper anzubrin-gen.
Zu guter Letzt wurden zwei neue so genannte Quantendefekte in SWCNTs eingebaut, welche zusätzlich eine Ankereinheit tragen, die nachfolgende kovalente Funktionali-sierung ermöglicht. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen der kovalenten SWCNT-Funktio-nalisierung führen Quantendefekte zu einer Rotverschiebung, nicht jedoch zu einer Lö-schung der NIR-Fluoreszenz. Durch Kombination dieser photophysikalischen Vorzüge mit den Ankereinheiten war es möglich, kovalente, funktionale und NIR-fluoreszente SWCNT-Nanobody-Konjugate, mehrfarbige SWCNTs sowie SWCNT-Peptid-Hybride her-zustellen. Mit der erhöhten Stabilität durch die kovalente Verknüpfung können diese An-kerquantendefekte nun als eine Plattformtechnologie dienen, um neue NIR-fluoreszente Werkzeuge für Biosensoren oder die Immunfluoreszenzmikroskopie herzustellen.
Zusammengefasst stellen diese vier Technologien (DNA-basierte Dopaminsensoren, ziel-gerichtete Sensoren mit Nanobodies, die Peptidfass-Ummantelung sowie die Quantende-fekt-Funktionalisierung) wertvolle neue Bausteine für die Herstellung von SWCNT-basier-ten optischen Sensoren, NIR-Werkzeugen für die Fluoreszenzmikroskopie oder Vehikeln für den zielgerichteten Transport von Medikamenten unter kontinuierlicher NIR-Observa-tion dar. In Zukunft könnten somit neue OpNIR-Observa-tionen für die Erkennung und Behandlung von Krankheiten generiert werden.
2 | Introduction
2.1 Motivation
The COVID-19 pandemic, which is currently spreading, has already cost the lives of more than 200,000 people at the time this work was completed.[1] Together with other soci-etal developments such as demographic change, which is resulting in an ever-increasing number and diversity of especially age-related diseases, these developments are placing an increasing burden on health systems. In order to counteract these developments, not only are functioning health care systems needed, but in particular suitable tools for a bet-ter understanding of diseases and their rapid and reliable detection. Over the last two decades, several novel diagnostic and therapeutic tools have been developed for the de-tection and treatment of cancer and other diseases, including cancer immunotherapy[2], CAR T cell therapy[3] or antibody/aptamer-based diagnostic devices. However, a large part of clinical diagnostics is still based on large and expensive equipment, which requires not only high acquisition costs but also trained personnel. In addition, many of these lab-oratory analyses are very time-consuming, which can lead to dramatic developments and e.g. undiscovered infections during a pandemic. With respect to age-related neurode-generative diseases such as Parkinson’s or Alzheimer’s, the tools to gain fundamental understanding are especially limited regarding their ability to resolve small, yet impor-tant events in intercellular communication and the malfunction thereof. To address these problems and develop new, better and faster diagnostic tools, more research is needed in the life sciences. This will allow new relationships to be uncovered, biomarkers for the early detection of diseases to be found and, ultimately, new devices to be developed.
These, in turn, will enable earlier diagnoses, leading to improved prognosis for patients and possibly lower costs for the health system.
In the last decade, nanotechnology has been demonstrated to be a great resource for building blocks of both diagnostic and therapeutic devices. Nanosized objects have the distinct advantage of being on the same length scale as the systems they are used to investigate. In addition, they can function as a scaffold for the attachment of multiple functional units responsible for different tasks such as targeting (e.g. antibody),
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2. Introduction
ing (e.g. fluorophore) and therapy (e.g. drug). In the future, these multifunctional devices could then potentially be injected, targeted to the desired site in the body, report on the disease status and directly release an appropriate drug in a targeted and thus less harmful fashion.
Carbon nanotubes are very promising candidates to fulfill these tasks. Compared to other nanomaterials, they provide the decisive advantage of having a valuable property for diagnostic or therapeutic devices already integrated - fluorescence. The near-infrared fluorescence of carbon nanotubes is even particularly suitable forin vivoimaging due to its enhanced tissue penetration properties compared to visible light. Furthermore, this fluorescence was shown to be dependent on the nanotube’s surrounding and can thus not only be used for static trackingin vivo, but also to report on changing environments
Figure 2.1.: Design strategies for carbon nanotube based biosensors. The goal of this work is the covalent and non-covalent functionalization of carbon nanotubes for the generation of novel optical biosensors as well as their targeted delivery to desired sites
2.1. Motivation such as different pH[4] in cancer tissue or even small signaling molecules.[5]
The goal of this work is on the one hand to develop new methods for expanding the reporting/sensor capabilities of this carbon-based nanomaterial and on the other hand to combine these readout properties with targeting approaches based on small antibody fragments - termed nanobodies. By combining these two key properties we can get an-other step closer to advanced diagnostic and therapeutic devices, which could ultimately help to provide a better and more affordable health-care for an aging society.
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2. Introduction