Der Transfer des MglA Proteins zum hinteren Zellpol leitet einen

Das Protein MglA lokalisiert am vorderen Zellpol in Zellen, die sich vorwärts bewegen (vergl. Kap. 4.2.5). Wechselt das Protein die Lokalisierung vom vorderen Ende der Zelle zum hinteren Zellpol ändert die Zelle ihre Bewegungsrichtung. Hinweis hierauf geben die durchgeführten Zeitrafferaufnahmen, in denen die dynamische Lokalisierung des YFP-MglA Proteins von dem vorderen Pol zum hinteren Zellpol in einer Zeit von ca. 3 bis 4 Minuten erfolgt. Jedesmal wenn das YFP-MglA Signal vollständig am hinteren Pol lokalisiert ist, führt die Zelle einen Richtungswechsel durch. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass MglA durch die Lokalisierung am hinteren Zellpol einen Richtungswechsel der Zellen induziert. Einen weiteren Hinweis hierauf gibt die dynamische Lokalisierung des MglA^gof Proteins. Zellen, die das YFP-MglA^gof Protein beinhalten, weisen eine dreifach erniedrigte Richtungswechselperiode, verglichen mit Wildtyp Zellen, auf wobei jedem Richtungswechsel ein Transfer des YFP-MglA^gof Proteins zum hinteren Zellpol vorrausgeht. Das YFP-MglA^gof Protein wandert sichtbar durch die Zellen hindurch, von dem vorderen Pol zum hinteren Zellpol und erst daraufhin

vollzieht die Zelle einen Richtungswechsel. Demnach besteht ein Zusammenhang zwischen der dynamischen MglA^gof Lokalisierung und den zellulären Richtungswechseln. Die dynamische Lokalisierung des MglA^gof Proteins basiert auf einem Transfer des Proteins durch die Zelle. Denn in Zellen, welche in Agar fixiert vorliegen und sich nicht vorwärts bewegen können, wandert das YFP-MglA^gof Protein ebenfalls innerhalb von ca. 4 Minuten von dem einen Pol der Zelle zum gegenüberliegenden Zellpol. Demnach kann ausgeschlossen werden, dass das MglA Protein relativ zur Umgebung an einer fixierten Position in der Zelle verbleibt und nur scheinbar zum hinteren Pol wandert, da sich die Zelle vorwärtsbewegt, wie es für die Lokalisierung des AglZ Proteins gezeigt wurde (Mignot et al., 2007).

Das MglA^lof Protein fusioniert zu YFP (YFP-MglA^lof) verteilt sich homogen in der gesamten Zelle ohne jegliche Lokalisierungsmuster innerhalb der Zelle aufzuweisen. In Zeitrafferaufnahmen konnte keine Änderung dieser homogenen Verteilung des YFP-MglA^lof beobachtet werden. Demnach scheint die MglA^lof Form eine homogene Verteilung der MglA Proteine in den Zellen zu bewirken.

Weiterhin bewirkt die homogene Verteilung bzw. die nicht polare Lokalisierung des MglA^lof Proteins eine Bewegungsunfähigkeit der Zellen.

Ausgehend von der beobachteten Lokalisierung der verschiedenen MglA Proteine haben wir das folgende Modell für die dynamische Lokalisierung des MglA Proteins aufgestellt. Im GDP gebundenen Zustand ist das MglA Protein inaktiv, verteilt sich homogen in der gesamten Zelle und die Zelle ist bewegungsunfähig. Eine niedrige bis mittlere Menge an MglA im GTP gebundenen Zustand (MglA-GTPN) lokalisiert am vorderen Zellpol. Hinweis hierauf gibt die Lokalisierung des nativen YFP-MglA Proteins, am vorderen Pol der Zelle. Wird eine erhöhte Menge an MglA im GTP gebundenen Zustand (MglA-GTPH) erreicht, so wird das MglA Protein an dem vorderen Zellpol freigesetzt und gelangt von dort zum hinteren Zellpol (Abb. 32). Diese Aussage wird gestützt durch den deutlich erkennbaren Transfer des YFP-MglA^gof Proteins (Kap. 4.2.6) von dem einem Pol zum anderen, verglichen mit dem weniger sichtbaren Transfer des YFP-MglA Proteins zwischen den Polen (Kap.

4.2.5). Weiterhin nehmen wir in unserem Modell an, dass MglA-GTPH an den hinteren Zellpol gelangt und dort vermutlich mit einem GTPase aktivierenden

Protein (GAP) interagiert, wodurch MglA-GTPH in MglA-GTPN überführt wird und erneut eine polare Lokalisierung von MglA-GTPN vermittelt wird (Abb. 32).

Im klassischen Fall binden GAPs spezifisch an eine GTPase im GTP gebundenen Zustand und stimulieren so die GTP Hydrolyse. Dementsprechend bewirken GAPs eine Verminderung der GTP gebundenen Form einer GTPase, jedoch stellen einige GAPs zusätzlich aktive Moleküle in einem Signaltransduktionsweg dar (McGlade et al., 1993, Scheffzek et al., 1998). Es wäre denkbar, dass durch die Bildung eines MglA-GTP-GAP Komplexes, gefolgt von einer GTP Hydrolyse, MglA-GTPH in MglA-GTPN überführt wird.

Diese Überführung vermittelt die polare Lokalisierung des MglA Proteins und garantiert, dass nicht ständig Richtungswechsel durchgeführt werden.

Einen experimentellen Hinweis auf die Bedeutsamkeit einer möglichen Interaktion von MglA-GTP mit einem GAP und die darauffolgenden GTP-Hydrolyse für die polare Lokalisierung von MglA-GTPN, gibt die fehlende polare Lokalisierung des MglA^gof und des MglA^lof Proteins. MglA^gof oszilliert ständig zwischen den Polen und verweilt nie lange an einem Zellpol. Denn das MglA^gof Protein verbleibt ständig im GTP gebundenen Zustand und kann dementsprechend keine GTP Hydrolyse durchführen. Dies resultiert in einem konstanten Level an MglA-GTPH, weshalb die polare Lokalisierung des Proteins nicht erfolgen kann. Das MglA^lof Protein liegt ständig in der GDP Form vor und zeigt deshalb weder eine polare Lokalisierung noch einen Transfer des Proteins zwischen den Polen. Demnach beruht die polare Bindung von MglA vermutlich auf der Erniedrigung des GTP gebundenen MglA Levels, vermittelt durch die Bildung eines GAP-MglA Komplexes, gefolgt von der GTP Hydrolyse.

Nach unserem Modell verbleibt MglA-GTP_N zunächst am Zellpol (Abb.

32). Vermutlich erst durch die Interaktion mit einem „Guanine nucleotide-exchange factor“ (GEF) wird die GTP Bindung an MglA stimuliert, die Menge an MglA im GTP gebundenen Zustand nimmt zu und es wird eine hohe Menge an MglA-GTP (MglA-GTP_H) erreicht, so wird MglA-GTP_H von dem Pol freigesetzt und wandert erneut im GTP gebundenen Zustand zum gegenüberliegenden Zellpol. Im Allgemeinen binden GEFs an eine GTPase im GDP gebundenen Zustand und katalysieren den Austausch von GDP zu GTP. In der Literatur wird für die GTPase Ras beschrieben, dass die GAP Interaktion häufig eine

Auswirkung auf die räumliche Verteilung der Ras Aktivität hat, während die GEF Interaktion eher die zeitliche Regulierung der Ras Aktivität kontrolliert (Ohba et al., 2003). Dies ist ebenfalls zutreffend für das MglA Protein in unserem Modell.

Gelangen die MglA-GTPH an den Zellpol so wird durch eine GAP vermittelte GTP Hydrolyse die polare Lokalisierung von MglA-GTP_N ermöglicht. Erst durch die katalysierende Wirkung eines GEFs bindet das MglA Protein erneut vermehrt GTP, es werden hohe Mengen an GTP erhalten und MglA-GTPH wird von dem Zellpol freigesetzt und ein neuer Zyklus der dynamischen MglA Lokalisierung beginnt.

Das erläuterte Modell könnte erklären wie der Transfer des MglA Proteins zwischen den Polen und die polare Lokalisierung des Proteins vermittelt wird. Wie zuvor beschrieben besteht ein Zusammenhang zwischen der dynamischen MglA Lokalisierung und den zellulären Richtungswechseln.

Jedesmal wenn das YFP-MglA Signal vollständig am hinteren Pol lokalisiert ist, führt die Zelle einen Richtungswechsel durch. Wird das Modell der dynamischen MglA Lokalisierung bezüglich der Einleitung der Richtungswechsel betrachtet (Abb. 32), so nehmen wir an, dass MglA-GTP_H an den hinteren Zellpol gelangt und dort mit GAPs und/oder Effektorproteinen interagiert. Diese Interaktion beeinflusst vermutlich die Polarität der A-Bewegungsmaschinerie und die Zelle wechselt ihre Bewegungsrichtung. Diese Annahme wird gestützt durch die Beobachtung, dass das Eintreffen des MglA^gof Proteins, welches ständig im GTP gebundenen Zustand vorliegt, am hinteren Zellpol einen Richtungswechsel einleitet. Im Allgemeinen interagieren GTPasen im GTP gebundenen Zustand mit einer vielzahl von GAPs und/oder Effektorproteinen und dies stimuliert eine zelluläre Antwort (Scheffzek et al., 1998, Hall & Nobes, 2000, Goldfinger, 2008). Die Überführung in den GDP gebundenen Zustand dient der Abschaltung der Aktivität des Proteins (Jaffe &

Hall, 2005). Dies ist ebenfalls zutreffend für MglA in unserem Modell, denn die Erniedrigung des Levels von MglA im GTP gebundenen Zustand und die polare Lokalisierung von MglA-GTPN garantiert in Wildtyp Zellen, dass nicht ständig Richtungswechsel durchgeführt werden, wie in einer mglA^gof Mutante, sondern nur wenn sie erforderlich sind.

Abbildung 32. Vereinfachtes Modell der dynamischen MglA Lokalisierung. Schematische Darstellung einer Zelle die ihre Bewegungsrichtung ändert. Gezeigt ist die Lokalisierung des MglA Proteins. Die Pfeile über der Zelle deuten die Bewegungsrichtung an. Eine detaillierte Beschreibung des Modells ist im Text zu finden.

Um dieses Modell experimentell überprüfen zu können, müssen zunächst GEFs und GAPs identifiziert werden, um anschließend deren Einfluss auf die MglA Lokalisierung zu testen. Zurzeit versuchen wir in Yeast-Two-Hybrid Experimenten eine Interaktion von MglA mit möglichen GEF bzw. GAP Kandidaten nachzuweisen. Wir erwarten, dass in GEF Mutanten das MglA Protein ständig am vorderen Zellpol verbleibt und dass die Zellen dieser Mutante sich nur in eine Richtung fortbewegen. In GAP Mutanten vermuten wir hingegen keine polare Lokalisierung von MglA und die Zellen sollten häufiger die Bewegungsrichtung ändern, als Wildtyp Zellen. Ein guter GAP Kandidat für MglA ist das Protein MglB, welches für die Bildung einer normalen Menge an MglA Protein in der Zelle benötigt wird (Hartzell & Kaiser, 1991). In Yeast-Two-Hybrid Experimenten interagiert das MglB Protein nicht mit dem MglA bzw. dem MglA^lof Protein, jedoch mit dem MglA^gof Protein, wie es für GAP Proteine in der Literatur beschrieben wird (Petters & Leonardy, unveröffentlicht). Aus diesem Grund werden wir eine mglB Mutante herstellen, um deren Phänotyp bezüglich

der Richtungswechsel zu analysieren und die Lokalisierung von MglA zu überprüfen. Zusätzlich werden wir die Lokalisierung des MglB Proteins mithilfe einer YFP Fusion in den Zellen untersuchen.

5.7 MglA arbeitet stromabwärts des Frz-Systems um zelluläre