oder Gedächtniszellen
Die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle korreliert mit der Aktivierung und verschiedenen Stadien der Differenzierung von CD8 T-‐Zellen. Die Expression der bereits besprochenen Moleküle CD44, Ly6C, CD62L, KLRG1, CD127 und CD27, sowie die Expression der Moleküle CD25, CXCR3, NKG2D und CD69 sollte untersucht werden, um
weitere Hinweise auf den Zustand und die Entwicklung der IRF4-‐defizienten OT-‐I T-‐Zellen zu erhalten.
An Tag fünf nach Transfer und Infektion wurden die Milzzellen gereinigt. Wildtyp und IRF4-‐defiziente OT-‐I T-‐Zellen wurden mit Hilfe von Fluorochrom-‐gekoppelten Antikörpern auf Expression der aufgezählten Moleküle im Durchflusszytometer analysiert (Abbildung 3.11).
Abbildung 3.11 Untersuchung des Phänotyps von Wildtyp und IRF4-defizienten CD8 T-Zellen Je 20.000 Wildtyp und IRF4-‐defiziente OT-‐I CD8 T-‐Zellen aus transgenen C57BL/6 Mäusen wurden zu gleichen Anteilen gemischt und in mit 1 × 105 LmOVA infizierte kongene C57BL/6 Empfängermäuse injiziert. An Tag fünf p.i. wurden die Lymphozyten aus der Milz aufgereinigt. Vor dem Transfer und an Tag fünf p.i. wurde die Expression der angegebenen Oberflächenmoleküle auf den OT-‐I T-‐Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Beispielhaft ist ein Experiment von zwei konsistenten Experimenten dargestellt. In den Histogrammen ist die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben. Die Balken stellen die arithmetischen Mittelwerte ± SEM (n≥3) in Prozent der OT-‐I T-‐Zellen dar. *p<0,05, **p<0,01,
***p < 0,001
CD44 und Ly6C wurden auf den Spenderzellen in vergleichbarer Stärke exprimiert. An Tag fünf p.i. waren die meisten Wildtyp OT-‐I T-‐Zellen für beide Moleküle positiv, was auf eine Aktivierung der Zellen hindeutet. Im Vergleich dazu wurde ein etwas geringerer Anteil der IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen CD44-‐ bzw. Ly6C-‐positiv. Zusätzlich zeigten die CD44-‐positiven IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen eine verminderte Expressionsstärke dieses Proteins.
CD62L und CD27 wurden auf allen naiven Spenderzellen exprimiert. Nach der Aktivierung durch die Infektion erfolgte eine deutliche Herunterregulation beider Proteine auf den Wildtypkontrollzellen, die auf den IRF4-‐defizienten OT-‐I T-‐Zellen nahezu komplett unterblieb.
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 1899
2269
0 103 104 105 0
20 40 60 80 10020009
% Max 8753
CD44
25 50 75
100 **
% CD44+
d0 d5
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 1855
2081
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 1197
731
25 50 75
% CD127+ **
d0 d5
% Max
CD127
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 931
801
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 3457
3023
25 50 75 100
% Ly6C+
d0 d5 Ly6C
0 103104105 0
20 40 60 80
100 105
153
0 103104105 0
20 40 60 80
100 2107
370
10 30 50
% CD25+
d0 d5
*
CD25
0 103 104 105 0
20 40 60 80 100 19472
24833
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 1849
13897
25 50 75
100 ***
% CD62L+
d0 d5 CD62L
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 463
583
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 4159
2634
25 50 75
100 ***
% CXCR3+
d0 d5 CXCR3
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 4120
5763
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 5802
9715
25 50 75
100 **
% CD27+
d0 d5 CD27
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 212
178
0 103 104 105 0
20 40 60 80
100 756
231
5 15
25 **
% NKG2D+
d0 d5 NKG2D
5 15 25
% KLRG1+
d0 d5
***
KLRG1
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 287
273
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 546
593
5 10 15
**
% CD69+
d0 d5 CD69
Irf4WT
-/-WT Irf4 -/-Spenderzellen
d5
Spenderzellen
d5
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 939
242
0 102 103 104 105 0
20 40 60 80
100 321
215
Beide Spenderzellpopulationen waren KLRG1-‐negativ. An Tag fünf p.i. wiesen etwa zwanzig Prozent der Wildtyp OT-‐I T-‐Zellen eine KLRG1-‐Expression auf. Die Expression dieses NK-‐Zellrezeptors war auf den IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen hingegen nicht nachweisbar.
Die CD127-‐Expression war für naive Wildtyp und IRF4-‐defiziente OT-‐I T-‐Zellen vergleichbar, nach Infektion sank sie bei beiden Populationen deutlich. Bei den IRF4-‐
defizienten CD8 T-‐Zellen war die Reduktion deutlicher und ein größerer Anteil war CD127-‐negativ.
CD25 ist die α-‐Untereinheit des hochaffinen IL-‐2-‐Rezeptors und wird nach Antigenstimulation exprimiert. IL-‐2 fördert die Proliferation und Differenzierung der T-‐Zelle {Williams et al. 2007}. Auf den nicht aktivierten Spenderzellen war kein CD25 detektierbar. An Tag fünf hatten etwa dreißig Prozent der Wildtyp OT-‐I T-‐Zellen eine CD25-‐Expression erworben, von den IRF4-‐defizienten OT-‐I T-‐Zellen hingegen weniger als zehn Prozent.
CXCR3 ist ein Chemokinrezeptor, der auf aktivierten CD8 T-‐Zellen exprimiert wird und das Migrationsverhalten in Infektionen beeinflusst {Groom et al. 2011, Kohlmeier et al.
2011, Kurachi et al. 2011}. Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigen, dass CD4 und CD8 T-‐Zellen, die im Rahmen einer Listerieninfektion aktiviert werden, CXCR3 positiv werden. Bei den Spenderzellen zeigte jeweils nur ein geringer Anteil eine CXCR3 Expression. Nach der Infektion waren über neunzig Prozent der Wildtyp Zellen und etwa achtzig Prozent der IRF4-‐defizienten Zellen CXCR3-‐positiv. Die Expressionsstärke von CXCR3 war jedoch bei IRF4-‐defizienten OT-‐I T-‐Zellen deutlich geringer.
NKG2D ist wie KLRG1 ein NK-‐Zellrezeptor der auf aktivierten CD8 T-‐Zellen exprimiert wird und bei Bindung seiner Liganden zur Zytotoxizität der Zellen beitragen kann {Champsaur et al. 2010}. Wie bei KLRG1 wiesen nur sehr wenige der naiven Spenderzellen beider Populationen eine NKG2D-‐Expression auf. Nach Aktivierung waren etwa zwanzig Prozent der Wildtyp OT-‐I T-‐Zellen NKG2D-‐positiv, aber nur fünf Prozent der IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen exprimierten NKG2D.
CD69 wird bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt der CD8 T-‐Zellaktivierung transient auf der Zelloberfläche exprimiert {Murphy et al. 2008}. Wie erwartet exprimierten die Spenderzellen kein CD69. Bei den Wildtyp Kontrollzellen fand sich an Tag fünf nur ein
geringer Anteil CD69-‐positiver Zellen, da die Expression vermutlich schon wieder abgesunken war. Erstaunlicherweise waren hingegen etwa acht Prozent der IRF4-‐
defizienten OT-‐I T-‐Zellen CD69-‐positiv.
Insgesamt ist festzustellen, dass die naiven Wildtyp und IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen einen vergleichbaren Phäntoyp aufwiesen. Nach Infektion zeigten sich aber deutliche Unterschiede für beinahe jedes untersuchte Protein. Die erhöhte Expression von CD44, Ly6C und CXCR3 deutet darauf hin, dass die OT-‐I T-‐Zellen im Verlauf der Infektion aktiviert wurden. Der fehlende Verlust von CD62L und CD27 zeigte jedoch, dass diese Aktivierung entweder nicht vollständig war oder die Differenzierung der Zellen einen anderen Verlauf nahm als die von Wildtypzellen. CD127 wurde auf beiden Zellpopulationen wie erwartet nach Aktivierung schwächer exprimiert als in naiven Zellen.
Die NK-‐Rezeptoren KLRG1 und NKG2D, sowie das zuvor untersuchte CD244 (Kapitel 3.2.7) sollten auf CD8 T-‐Effektorzellen die Zytotoxizität unterstützen. Diese Moleküle fehlten auf den aktivierten IRF4-‐defiziente Zellen nahezu komplett, was auch mit der verminderten Zytotoxizität korreliert (Kapitel 3.2.9).
Durch die CD25-‐Expression werden CD8 T-‐Zellen sensitiv gegenüber dem mitogenen Zytokin IL-‐2. Die marginale CD25 Expression auf IRF4-‐defizienten Zellen könnte den proliferativen Nachteil dieser Zellen erklären. Überraschenderweise findet sich auf IRF4-‐defizienten Zellen an Tag fünf noch immer das frühe Aktivierungsmolekül CD69.
Eine Erklärung wäre eine Blockade oder Verzögerung der Differenzierung dieser Zellen, die sich ja bis Tag drei vergleichbar zu den Kontrollzellen entwickelt hatten.
Das Expressionsprofil der aktivierten IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen weist insgesamt viele Merkmale naiver CD8 T-‐Zellen auf. Naive CD8 T-‐Zellen haben aber viele Überschneidungen im Phänotyp mit Gedächtniszellen. Die deutlichen Hinweise auf die Aktivierung von IRF4-‐defizienten T-‐Zellen deuten daher entweder auf eine Blockade der Differenzierung oder auf eine präferentielle Entwicklung zu Gedächtniszellen hin. Im nächsten Teil der Arbeit sollte deshalb untersucht werden ob sich die IRF4-‐defizienten CD8 T-‐Zellen zu Gedächtniszellen entwickeln können.
3.3 Teil 2 – Die Rolle von IRF4 für das CD8 T-Zellvermittelte immunologische