Deconvolution of High Binding Affinities Using Temperature

Another possibility to influence binding affinities is the temperature. It is connected to G and the affinity constant Ka via the Gibbs-Helmholtz equation

Δ𝐺 = Δ𝐻 − 𝑇Δ𝑆.

Upon raising the temperature, the influence of TS grows. Since S is positive for all ligands, G and so the binding affinity should decrease. The influence of the temperature was tested with ligand 111 at a series of temperatures. The results are summarized in Table 16.

Table 16 Thermodynamic data derived from ITC of ligand 111 binding to WGA at various temperatures and pH = 7.

[a] Stoichiometry of binding (ligands per WGA dimer).

Indeed, the affinity decreases at elevated temperatures to 40 nM at 60 °C. Yet this is a less prominent decrease than obtained using GlcNAc as inhibitor. Interestingly also the stoichiometry varies between 1

and 0.5 (ligands to protein dimer) without an obvious trend. The data at 60 °C is of poor quality since in this region the stability of the protein rapidly decreases. At 40 and 50 °C, which are feasible in terms of protein stability, the affinity decreases only to 13 and 30 nM respectively. This makes the temperature not the ideal parameter to obtain a better resolution in affinity to compare strongly binding ligands.

In this chapter different approaches to tackle the problem of the high affinity detection limit of ITC have been described involving competitive ITC and temperature dependent measurements. The results are promising and could be further developed to allow the determination of sub-nanomolar affinities of multivalent lectin ligands by ITC.

The first part of this work was a systematic investigation of the binding mode of multivalent glycopeptides to the lectin wheat germ agglutinin (WGA). Starting point was cyclic peptide 20 that had shown an exceptionally high binding affinity and could also be crystallized together with the protein.^[11]

However, it could not be revealed whether the high affinity stemmed from the conformationally restricted backbone of the cyclic peptide and how the carbohydrate residues that were not resolved in the crystal structure were involved in the binding. To shed light on these questions, twelve glycopeptide analogs of 20 were synthesized, among them linear equivalent 31, the divalent cyclic and linear compounds 30 and 34 or truncated peptide 33 (Figure 62).

Figure 62 Selected glycopeptides as ligands for WGA, synthesized within this work.

Combined evidence from isothermal titration calorimetry (ITC), enzyme linked lectin assays (ELLA), dynamic light scattering (DLS), analytical ultracentrifugation (AUC), and precipitation studies revealed detailed insight into the binding mechanism of these kind of peptides. Regardless of the cyclic or linear structure of the backbone, very high binding affinities with Kd values in the low nanomolar range were achieved for all tetravalent peptides. It was shown that the tetravalent ligands bind to the protein in a one to one stoichiometry and the protein was partly precipitated which can be explained by a crosslinking binding mode that leads to big insoluble ligand-protein complexes (Figure 63 B and C). At

values drops from the nanomolar to the micromolar range and aggregation does not occur. At the same time the binding stoichiometry rises to a two to one ratio of ligand to protein dimer. These findings can only be explained by a chelating binding mode as depicted in Figure 63 D.

Figure 63 Binding modes of glycopeptides, WGA dimers are represented by gray ellipses, ligands drawn in black:

(A) Soluble complexes of tetravalent ligands and WGA, (B), (C) insoluble complexes of tetravalent ligands and WGA and (D) chelating binding mode of divalent glycopeptides and WGA.

These results show the strong dependency of binding affinity and binding mode on the multivalent system that is used. The structure and architecture of the ligands and the distribution of binding sites on the protein may lead to different binding modes that can be in action simultaneously and in different proportions. This emphasizes the manifold possibilities to design ligands that are tuned to achieve certain binding modes and maximize binding affinities.

However, when thinking of a specific application for a lectin ligand, for example to inhibit viral adhesion to host cells, a defined single binding mode with a high affinity is desired. Precipitation processes in the blood vessels can be dangerous and thus ligands that induce heavy crosslinking are not optimal candidates in such a case. In the second part of this work, high affinity ligands for WGA that are binding to the protein without inducing precipitation have been designed, synthesized and investigated.

Divalent ligands with appropriate linkers are capable of bridging adjacent binding sites on WGA in a chelating manner and were the starting point for the investigations. First a series of divalent ligands was synthesized to determine the optimal linker length that leads to the highest affinity (Figure 64). Ligand

A

C D

B

25 turned out to be the candidate with the highest affinity. In earlier studies this ligand had also been crystallized with WGA confirming the chelating binding mode.

Figure 64 Divalent ligands for WGA synthesized within this work to determine the optimal length of the linker.

A closer look at the crystal structure revealed the opportunity to create a tetravalent ligand based on ligand 25 by simply connecting the 6-OH groups with a suitable linker (Figure 65). The resulting ligand differs from all other known multivalent lectin ligand designs. Usually the carbohydrates are connected via linkers to a central scaffold structure that can have many different geometries. The new ligands presented here integrate two carbohydrate moieties into the backbone structure (Figure 65 A and B) and were termed “Linear Lectin Ligands (LLL)”. The connecting linker between the 6-positions was varied in length including examples that were not capable to cross the distance indicated by the dashed curve in Figure 65 A. Also spin labeled derivatives for an in depth examination of the binding mode were synthesized.

The binding affinities were determined by ITC and ELLA experiments. The results showed that all ligands of the series had exceptionally high binding affinities with Kd values in the low nanomolar range.

Ligand 117, having a Kd value of 1.6 nM, turned out to be the ligand with the highest affinity reported until now. Further investigations by competitive ITC experiments revealed that the affinity of 117 was 9 times higher compared to analog 111 with the shortest linker 2 and even 46 times higher than for linear glycopeptide 31. This already demonstrates the power of the new ligand design. For the further investigation of the binding modes DLS, precipitation studies, and EPR experiments were performed and distinct binding modes could be deduced. For ligands 111–114 a crosslinking binding mode is in action with two ligands binding to two proteins (Figure 66 A). For ligands 115–117 a chelating binding mode with one ligand binding to one protein is found (Figure 66 B). This is also the first example of a ligand that is capable to chelate four binding sites on one WGA dimer simultaneously.

Figure 66 Binding modes of LLLs: (A) One possible crosslinking binding mode of ligands 111–114 (B) Chelating binding mode of ligands 115–117.

In summary a novel ligand design for the creation of high affinity multivalent lectin ligands that bind in a defined manner without precipitating the protein has been developed. The novel structural feature of carbohydrates integrated into the scaffold lead to unique structures that have unprecedented binding characteristics.

This new concept should in the future be transferred to lectins that are medically relevant to create ligands with potential therapeutic applications. Targets could be for example hemagglutinin of influenza virus, galectins, or certain toxins that contain a lectin functionality. Of course the lectins have to fulfil certain structural criteria that allow a ligand design where the carbohydrates are integrated into the scaffold. Certainly this is not feasible for all multivalent lectins. Nevertheless, the new ligand design is very promising and should be further pursued in a medical context.

Lektine spielen eine bedeutende Rolle in Organismen. Als Bindungspartner für die Kohlenhydratstrukturen an Glycoproteinen oder Glycolipiden, welche insbesondere auf Zelloberflächen zu finden sind, wirken sie entscheidend bei der Zell-Zell Adhäsion und Kommunikation mit. Ein prominentes Beispiel solcher Adhäsionen ist der erste Schritt einer Virusinfektion. Um in eine Zelle eindringen zu können, muss das Virus zunächst an der Zelloberfläche anhaften bevor eine Endozytose stattfinden kann. Dies geschieht im Falle des Influenzavirus durch nichtkovalente Wechselwirkungen des Lektins Hämagglutinin auf der Virusoberfläche mit endständigen Sialinsäuren auf der Zelloberfläche. Auch Toxine, wie Shigatoxin, Choleratoxin oder Rizin, nutzen diesen Mechanismus um in eine Zelle einzudringen. Diese adhäsive Wirkung der meisten Lektine beruht auf Multivalenz. Oft sind diese aus mehreren homologen Proteinmonomeren aufgebaut und besitzen dadurch mehrere Bindungstaschen für Kohlenhydrate. Eine einzelne Wechselwirkung eines Saccharids mit einer Bindungstasche ist für gewöhnlich schwach. Die Kd-Werte liegen im millimolaren Bereich. Können jedoch mehrere Saccharide, die sich beispielsweise auf der Zelloberfläche befinden, mit mehreren Bindungstaschen eines Lektins gleichzeitig interagieren, wird die Wechselwirkung multivalent.

Dadurch kann sich die Affinität des multivalenten Systems gegenüber der eines einzelnen Saccharids um mehrere Größenordnungen erhöhen. Um diese multivalenten Wechselwirkungen zu untersuchen und im Falle von Pathogenen zu unterbinden, sind synthetische, multivalente Liganden nötig.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe multivalenter Glycopeptide synthetisiert und die Beziehung von Struktur der Liganden und Bindungsaffinität bzw. Bindungsmodus an das Lektin Weizenkeimagglutinin (WGA) untersucht. WGA besitzt acht Bindungstaschen für N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und wird häufig als Modellsystem zur Untersuchung multivalenter Kohlenhydrate-Lektin Wechselwirkungen verwendet. Die hergestellten Peptide tragen vier (tetravalent), drei (trivalent) oder zwei (divalent) GlcNAc Reste und unterschieden sich zudem in der Struktur des Peptidgerüsts, welches cyclisch oder linear mit unterschiedlicher Sequenzlänge dargestellt wurde (Figure 67). Es sollte überprüft werden ob ein starres cyclisches Peptidgerüst gegenüber einem linearen Analogon zu höheren Affinitäten führt, welchen Einfluss die Sequenzlänge der linearen Peptide auf die Bindung hat und inwiefern sich die Anzahl der vorhandenen GlcNAc Reste auf die Wechselwirkung auswirkt. Die tetravalenten Glycopeptide zeigen äußert hohe Affinitäten mit Kd-Werten im Bereich 6–8 nM, welche durch isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) bestimmt wurden. Gleichzeitig konnte durch dynamische Lichtstreuung (DLS) und Präzipitationsstudien gezeigt werden, dass die Liganden mehrere Kopien von WGA zu kleinen oligomeren und größeren, unlöslichen polymeren Protein-Ligand Komplexen verbrückten. Die divalenten Liganden zeigten Kd Werte im Bereich 0.1–1 µM, was einer

denen der tetra- und divalenten Liganden. Dabei treten in Abhängigkeit des Verhältnisses Protein zu Ligand sowohl chelatisierende als auch verbrückende Bindungsmodi auf. Präzipitation wurde jedoch nicht beobachtet.

Figure 67 Beispielstrukturen tetravalenter (20, 31) und divalenter (35) Glycopeptide.

Im Hinblick auf eine medizinische Anwendung multivalenter Lektinliganden wäre ein Ausfallen und Verklumpen der Zielproteine, wie es bei den tetravalenten Glycopeptide beobachtet wurde, im Organismus von Nachteil. Im zweiten Teil der Arbeit sollte ein neues Ligandendesign entwickelt werden, welches hochaffine Liganden ermöglicht ohne eine Ausfällung des Proteins zu bewirken. Der

„klassische“ Ansatz multivalente Lektinliganden zu synthetisieren ist das Anknüpfen mehrerer Kohlenhydrate über geeignete Linker an ein zentrales Grundgerüst. Im Gegensatz dazu wurde hier der Ansatz verfolgt, die Kohlehydrate in das Gerüst zu integrieren. Dadurch reduziert sich die molare Masse im Vergleich zu einem konventionellen System mit zentraler Gerüststruktur. Zudem sind die Kohlenhydrate an mehreren Stellen im Gerüst integriert, was ein Dissoziieren im gebundenen Zustand am Lektin erschweren und zu einer stärkeren Bindung führen sollte. Ausgangspunkt für die Synthese war eine Kristallstruktur von WGA mit einem divalenten Liganden der in der Lage ist zwei benachbarte Bindungstaschen chelatisierend zu verbrücken. Zunächst wurde ausgehend von diesem divalenten Liganden der Linker, welcher die beiden Kohlenhydrate verbrückt, optimiert. Danach wurden zwei dieser divalenten Liganden an den Kohlenhydraten über Linker verschiedener Länge zu tetravalenten Liganden verknüpft (Figure 68). Die Liganden zeigen bei ITC Messungen und einem enzymgekoppelten Lektin-Assay (ELLA) außergewöhnlich hohe Affinitäten, wobei die Verbindung mit dem Kd-Wert von 1.6 nM momentan den affinsten aller bekannten Liganden für WGA darstellt. Zudem konnte durch Präzipitationsstudien gezeigt werden, dass keiner der Liganden in der Lage ist das Protein auszufällen.

Um den Bindungsmodus weiter zu untersuchen wurden zwei doppelt spingelabelte Derivate

synthetisiert und mittels Elektronenspinresonanzspektroskopie untersucht. Zusammen mit den Ergebnissen aus DLS Messungen ließen sich definierte Bindungsmodi für die neuen Liganden ableiten.

Liganden mit einem kurzen Linker zur Verbrückung der divalenten Substrukturen bildeten dimere Komplexe mit WGA in einer Stöchiometrie von 2:2 (Ligand zu Protein). Die Liganden mit einem längeren Linker waren hingegen in der Lage vier Bindungstaschen auf einem Protein in einer Stöchiometrie von 1:1 zu verbrücken.

Figure 68 Lektinliganden 111–117 mit Kohlenhydraten innerhalb des Grundgerüsts.

Im dritten Teil der Arbeit wurden verschieden Ansätze zur Untersuchung hochaffiner Liganden durch kompetitive ITC Experimente getestet. Die Messgrenze der Kd-Werte bei ITC Experimenten liegt im Bereich von 1 nM, sodass die Auswertung und der Vergleich von Wechselwirkungen in diesem Bereich problematisch sein können. Eine Lösung dafür sind kompetitive Experimente für welche jedoch noch keine Beispiele mit multivalenten Liganden beschrieben wurden. Hier wurde unter anderem ein divalenter Ligand mit GalNAc anstelle von GlcNAc erfolgreich eingesetzt um die Affinität des analogen GlcNAc Liganden herabzusetzen, was die Voraussetzung für ein kompetitives Experiment ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass Monosaccharide geeignet sind um die durch ITC gemessenen Kd Werte hochaffiner Liganden zu relativen Kd-Werten zu verringern, was eine genauere Abstufung der hochaffinen Liganden zulässt.

Die gewonnenen Erkenntnisse können dazu beitragen Liganden für medizinisch relevante Lektine zu entwickeln, welche durch hochaffine Wechselwirkunken mit definierten Bindungsmodi und ohne Präzipitation der beteiligten Bindungspartner in die betroffenen Prozesse eingreifen können.