Das Transfektionssystem

4.1.1 Versuchsaufbau – Übersicht –

Das verwendete Modellsystem besteht aus der Epithelzelllinie HEK293, dem EBV-Genom in Form eines rekombinanten Plasmids (maxi-EBV-DNA) und zwei verschiedenen Expressionsplasmiden für virale lytische Gene. Unterschiedliche Kombinationen von unmodifizierter oder modifizierter, aus E.coli gewonnener maxi-EBV-DNA mit Expressionsplasmiden wurden verwendet. Die Zellen wurden transient transfiziert und die virale Genexpression mit verschiedenen Methoden untersucht.

4.1.1.1 Das maxi-EBV-Konstrukt p2089

Abbildung 4.1 zeigt eine schematische Darstellung des p2089-maxi-EBV-Plasmids.

p2089 ist ein rekombinantes EBV-Genom, das das Wildtyp-EBV-Genom von B95.8 umfasst. Zusätzlich kodiert p2089 für weitere Gene, die eine Selektion der EBV-DNA ermöglichen oder die, wie das „green fluorescent protein“ (GFP), als phänotypischer Marker in transfizierten und infizierten Zellen dienen.

Abb. 4.1: Karte des maxi-EBV-Plasmids p2089

Das maxi-EBV-Plasmid p2089 umfasst das Genom des EBV Prototypvirus B95.8. Durch den Einbau des F-Faktors wird die Amplifikation in E. coli sichergestellt und durch das Chloramphenicol Resistenzgen eine erfolgreiche Selektion ermöglicht. GFP und das Hygromycin-Resistenzgen dienen der Selektion in eukaryontischen Zellen. Herausgestellt ist die Lage fünf paradigmatischer lytischer Gene, deren Transkripte in dieser Arbeit als Nachweis der Genexpression in der lytischen Phase dienen.

4.1.1.2 Zelllinien

B95.8 geht auf Krallenaffen-B-Zellen zurück, die durch EBV-Infektion in eine lymphoblastoide Zelllinie transformiert wurden (Miller et al., 1972). Der Großteil der B95.8-Zellen ist latent mit EBV infiziert, während 5-10% der B95.8-Zellen spontan den lytischen Zustand unterstützen (zur Hausen et al., 1978). Diese Zelllinie wurde als Positivkontrolle für Immunfluoreszenz- und RT-PCR Analysen verwendet.

Die HEK293-Zelllinie ist eine humane embryonale Nierenepithel-Zelllinie. In dieser Zelllinie wurde nach transienter Transfektion von maxi-EBV-DNA die virale Genexpression untersucht, um die Restriktion im abortiv lytischen Zyklus zu definieren.

In meiner Arbeit wurden zwei weitere, bereits stabil mit EBV transfizierte HEK293-Zelllinien als Kontrollen verwendet. In diesen Zellen repliziert das

maxi-EBV-Plasmid extrachromosomal, sodass ein der latenten EBV-Infektion entsprechender Zustand entsteht. Eine spontane Produktion von Viruspartikeln findet im latenten Zustand in diesen Zellen nicht statt. Der Übergang vom latenten in den produktiven lytischen Zustand kann aber durch die transiente Expression des viralen Transaktivators BZLF1 in stabil mit EBV transfizierten Zelllinien induziert werden (Hammerschmidt and Sugden, 1988).

Nach Induktion der lytischen Phase setzt die HEK293/2089-Zelllinie Viren frei, die effizient humane primäre B-Lymphozyten infizieren und transformieren (Delecluse et al., 1998). Diese Viren können sehr sensitiv durch die Infektion von B-Blasten mit Zellkulturüberständen von transient transfizierten HEK293-Zellen detektiert werden. EBV-infizierte B-Blasten wachsen in der Zellkultur als LCLs aus.

Die HEK293/TR^–-Zelllinie ist mit dem maxi-EBV-Plasmid p2114 stabil transfiziert (Delecluse et al., 1999). Nach Induktion des lytischen Zyklus in dieser Zelllinie kommt es zur Expression aller lytischen Gene. Im Gegensatz zur HEK293/2089-Zelllinie setzt die HEK293/TR^–-Zelllinie aber keine infektiösen Viren frei, da dem rekombinanten EBV-Genom die viralen Verpackungssequenzen fehlen.

Diese Zelllinie diente als Positivkontrolle der lytischen Genexpression in Immunfluoreszenz- und RT-PCR-Analysen.

4.1.1.3 Expressionsplasmide

BZLF1 und BRLF1 sind die essentiellen molekularen Schalter, deren Expression für die Initiation des lytischen Zyklus unerlässlich sind (Countryman et al., 1987;

Countryman and Miller, 1985; Feederle et al., 2000; Shimizu et al., 1989). So aktivieren deren Genprodukte Zta und Rta die Promotoren des eigenen und des jeweils anderen Gens sowie die weiterer lytischer Gene (Chen et al., 2005;

Chevallier-Greco et al., 1986; Cox et al., 1990; Feederle et al., 2000; Francis et al., 1999; Holley-Guthrie et al., 1990; Quinlivan et al., 1993). Durch diese Interaktion kommt es zum Ablauf des vollständigen lytischen Zyklus und zur Virusneusynthese in latent infizierten bzw. stabil transfizierten Zellen.

Von den Expressionsplasmiden p509 und p2130 wird BZLF1 bzw. BRLF1 konstitutiv durch den CMV-Promotor transkribiert. Die ektopische Expression von BZLF1 und/oder BRLF1 wurde in transienten Transfektionen zusammen mit maxi-EBV-DNA benutzt, um den Block der abortiv lytischen Phase zu untersuchen.

4.1.1.4 Nachweis transfizierter EBV-DNA

Die effiziente Induktion des lytischen Zyklus hängt in erster Linie von der DNA-Transfektionseffizienz ab. Deshalb wurde während dieser Arbeit versucht, folgende Parameter zu optimieren: (i) Zahl der zu transfizierenden HEK293-Zellen, (ii) Menge der maxi-EBV-DNA, (iii) Menge der Expressionsplasmid-DNA und (iv) Konzentration des Transfektionsreagenzes Polyethylenimin (PEI) in Kombination mit dem Transfektionsmedium Optimem.

Die Menge an zu transfizierenden Zellen wurde so gewählt, dass die HEK293-Zellen nach dreitägiger Transfektion nicht vollständig konfluent ausgewachsen waren, sondern sich weiterhin in ihrem proliferierenden Zustand befanden. Die optimale Menge an einzusetzender p2089-maxi-EBV-DNA wurde durch Auszählen GFP-positiver HEK293-Zellen drei Tage nach Transfektion bestimmt. Das Optimum stellte sich bei einer Transfektion mit 5!g maxi-EBV-DNA ein. In Versuchen mit de novo methylierter p2089-maxi-EBV-DNA konnte die Transfektionseffizienz durch Auszählen GFP-positiver HEK293-Zellen nur unzureichend bestimmt werden:

regelmäßig wurden nach Transfektion von identischen DNA-Mengen bei CpG-methylierter EBV-DNA im Vergleich zu unCpG-methylierter p2089-maxi-EBV-DNA 80%

weniger GFP-positive Zellen gezählt. Dies resultiert wohl aus einer epigenetischen Repression des GFP-Promotors in methylierter DNA. Da aber die CpG-Mehylierung sehr wahrscheinlich die Transfektionseffizienz der DNA nicht beeinflusst, wurde bei Transfektionen dieselbe Menge an unmodifizierter bzw.

modifizierter DNA verwendet. Die beiden Expressionsplasmide p509 und p2130 tragen keine Markergene, sodass ich deren Transfektioneseffizienz indirekt mit Hilfe von Fluoreszenzanalysen der jeweils exprimierten Gene bestimmt habe. Vergleicht man in Abbildung 4.4 (Kapitel 4.2.1.2) die Expression von Zta in Reihe 1 und 2, erkennt man nach Transfektion mit dem BZLF1-Expressionsplasmid klar die Zta-exprimierenden, fluoreszierenden HEK293-Zellen. Diese Situation trifft auch für Rta zu (Vergleich von Reihe 1 und 2 mit 3 und 4). Der Einsatz von jeweils 0,5!g Expressionsplasmid-DNA führt zu einer ausreichend starken ektopischen Expression der beiden lytischen Gene BZLF1 und BRLF1. Die optimale Menge des Transfektionsreagenz PEI wurde durch Transfizieren von konstanten DNA-Mengen (maxi-EBV und Expressionsplasmid) mit unterschiedlichen Mengen PEI ermittelt. Die beste Transfektionseffizienz wurde in folgendem Verhältnis erhalten: 5!g

maxi-EBV-DNA und 0,5!l jedes Expressionsplasmids in 12!l PEI und einem Endvolumen von 2ml Optimem. Das in diesen Vorarbeiten erarbeitete Protokoll (siehe Kapitel 3.2.2) wurde während meiner Arbeit bei allen transienten Transfektionen verwendet.