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Antikörperkonstrukte!

5.1.2 Darstellung!als!humane!Fab=Fragmente!

!

Ein! FabRFragment! (fragment* antigen8binding)! bildet! eine! antigenbindende! Einheit,! die!

sich! aus! der! leichten! Immunglobulinkette! (VL)! sowie! der! VHR! und! CH1RDomäne! der!

schweren! Kette! zusammensetzt.! Es! handelt! sich! damit! um! ein! monovalentes!

Bindungsmolekül.! Bleibt! die! Disulfidbrücke! zwischen! den! beiden! AntikörperR Fragmenten! bestehen,! werden! bivalente! F(ab)2RFragmente! generiert.! Durch! die!

Ermittlung!der!Raumstruktur!eines!AntigenRFabRKomplexes!nach!einer!Kokristallisation!

können! detaillierte! Informationen! über! die! Relevanz! einzelner! Aminosäuren! für! die!

Wechselwirkung! beider! Bindungspartner! gewonnen! werden.! Aufgrund! ihrer! starren!

Struktur! eignen! sich! FabRFragmente! besonders! für! eine! Analyse! von! Epitopen.! Dabei!

kristallisieren!sie!aus!und!werden!mit!einer!Röntgenstrukturanalyse!untersucht.!ScFvR Fragmente! (single* chain* variable* fragment),! eine! der! kleinstmöglichen! BindungsR determinierenden!AntikörperREinheit,!sind!für!derartige!Analysen!oft!zu!flexibel.!

Zur! Herstellung! der! FabRFragmente! wurden! drei! verschiedene! Strategien! verfolgt:! die!

proteolytische! Spaltung! von! Vollantikörpern,! sowie! die! prokaryotische! und!

eukaryotische!Expression.!!

Da! hinter! der! Darstellung! rekombinanter! humaner! FabRFragmente! ein! kompliziertes!

wie! auch! zeitR! und! kostenaufwändiges! Ineinandergreifen! verschiedener!

molekularbiologischer! Methoden! wie! der! Entwicklung! geeigneter! KlonierungsR! und!

Expressionsstrategien! steht,! wurde! zur! Produktion! der! FabRFragmente! zunächst! die!

Spaltung! intakter! Immunglobuline! angewendet.! ImmunglobulinRDomänen! sind!per*se!

vergleichsweise! inert! gegen! enzymatische! Spaltungsreaktionen.! Allerdings! können! in!

der! flexiblen!HingeRRegion! des! Antikörpers! mithilfe! der! Cysteinpotease! Papain! (die!

Frucht! Papaya! enthält! hohe! Konzentrationen! des! Enzyms)! AminosäureRVerbindungen!

aufgetrennt!werden.!Zur!Darstellung!von!FabRFragmenten!erfolgte!die!PapainRSpaltung!

von! jeweils! einem! Milligramm! gereinigtem! Antikörper.! Dabei! wurde! die! enzymatische!

Spaltungsdauer!variiert.!Durch!die!Verlängerung!der!Inkubationszeit!von!4!Stunden!auf!

6! Stunden! wurde! der! Anteil! an! ungespaltenem! IgGRAntikörper! deutlich! verringert,!

allerdings! zeigte! die! Analyse! im! Immunoblot! bereits! bei! einer! Inkubationszeit! von! 4!

Stunden! eine! unerwünschte! Fragmentierung! des! Antikörpers.! Um! Nebenprodukte! aus!

der! Probe! zu! entfernen,! wurde! an! die! Reinigung! mittels!κRspezifischer! Matrix! eine!

Aufreinigung! über! Protein! A! angeschlossen.! Durch! dieses! Vorgehen! konnte! die!

Konzentration! unerwünschter! Nebenprodukte! deutlich! reduziert! werden.!

Zusammenfassend!war!jedoch!die!Ausbeute!des!FabRFragmentes!aufgrund!der!Bildung!

der! Nebenprodukte! zu! gering! und! der! Aufwand! bedingt! durch! aufeinanderfolgende!

Reinigungsschritte! vergleichsweise! hoch.! Eine! präparative! Darstellung! würde!

außerordentlich! hohe! Mengen! von! IgG! erfordern,! was! eine! Anwendung! als! generelle!

Strategie!als!unrealistisch!erscheinen!lässt.!Aus!diesem!Grunde!erfolgte!als!alternative!

Strategie!eine!Reklonierung!der!Antikörper!in!das!FabRFormat.!!

Der! Vorteil! einer! FabRExpression! im! prokayotischen! System! liegt! in! einer! ZeitR! und!

Kostenersparnis.! Zur! Darstellung! eines! FabRFragmentes! im! prokaryotischen! System!

wurde! das! StarGateRFusionsklonierungssystem! von! IBA*BioTAGnology! verwendet.!

Dieses! System! erlaubt! in! drei! aufeinander! folgenden! Reaktionsschritten! eine!

Assemblierung!der!VHCH1R!und!VLCLRSequenzen!in!den!gewünschten!Expressionsvektor.!

Obgleich!die!FabRExpression!in!Bakterien!ein!fest!etabliertes!Verfahren!darstellt,!lieferte!

die! initiale! Expression! des! Antikörperfragmentes! hier! nur! eine! geringe! Ausbeute.! Zur!

Optimierung! der! Darstellung! des! FabRFragmentes! wurden! anschließend!

unterschiedliche! Expressionsbedingungen! geprüft.! Zudem! wurde! neben! dem!

periplasmatischen!Extrakt!auch!der!Gesamtzellextrakt!gewonnen!und!das!FabRFragment!

mittels! Reinigung! über! NiRNTARMatrix! isoliert.! Die! anschließende! SDSRPAGERAnalyse!

zeigte,! dass! lediglich! in! den! Fraktionen! des! Gesamtzellextraktes! das! FabRFragment!

detektiert!werden!konnte.!Die!Expression!über!Nacht!bei!30!°C!und!220!rpm!lieferte!die!

höchste! Ausbeute,! welche! jedoch! noch! weiter! optimiert! werden! müsste.! Die!

nachfolgende! ELISARAnalyse! des! dargestellten! FabRFragmentes! ergab! eine! signifikante!

Reaktivität! mit! Phl!p!5a! und! bestätigte! die! erfolgreiche! Darstellung! des! Phl!p!5aR spezifischen!FabRFragmentes.!

Zur!Optimierung!der!prokaryotischen!Expression!könnte!gegebenenfalls!ein!alternativer!

Expressionsvektor!eingesetzt!werden.!Der!verwendete!E.*coliRExpressionsvektor!pASGR IBAR44!besitzt!einen!TetRPromotor,!welcher!in!seiner!Expressionsstärke!nicht!mit!dem!

starken! T7RPromotor! vergleichbar! ist.! Zudem! zeigte! die! SDSRPAGERAnalyse,! dass! aus!

dem! periplasmatischen! Raum! kein! FabRFragment! isoliert! werden! konnte.! Dies! deutet!

auf! eine! fehlerhafte! Translokation! des! Antikörperfragmentes! hin.! Eine! andere!

Signalsequenz! könnte! sich! daher! positiv! auf! die! funktionelle! Expression! des! FabR Fragmentes! auswirken.! Die! Expressionskassette! des! Phl!p!5aRspezifischen! FabR Konstruktes!in!pASGRIBAR44!enthält!NRterminal!von!der!VHRSequenz!eine!OmpAR!und!NR

terminal! von! der! VLRSequenz! eine! PhoARSignalsequenz.! Diese! bewirken! über! das! SecR System! (Sec,! secretion)! von! E.*coli! die! posttranslationale! ProteinRtranslokation.! In!

Studien! konnte! gezeigt! werden,! dass! die! Verwendung! von! SRPRSignalsequenzen! (SRP,!

signal* recognition* particle)! eine! bis! zu! 700fache! Steigerung! der! Translokation!

ermöglichen! (Steiner!et*al.,! 2006).! Im! Gegensatz! zu! dem! SecRSystem! vermitteln! SRPR Signalsequenzen!eine!kotranslationale!Zielsteuerung!der!Proteine.!Insgesamt!erscheint!

jedoch!die!prokaryotische!Expression!als!schwierig.!Auch!inwieweit!die!hier!erhaltenen!

Proteine!von!homogener!Qualität!sind,!was!jedoch!von!entscheidender!Bedeutung!wäre,!!

ist!auf!der!Grundlage!der!hier!erhaltenen!Daten!kaum!zu!beurteilen.!!

Als! zielführendste! Strategie! stellte! sich! jedoch! die! Expression! in! eukaryotischen! Sf9R Insektenzellen! heraus.! Hierzu! erfolgte! u.a.! eine! Optimierung! des! zugrundeliegenden!

Expressionsvektors.! Dieser! verfügte! anfänglich! über! zwei! identische! gp67R Signalsequenzen.! Durch! die! Modifikation! einer! der! beiden! gp67RSequenzen! in! Form!

einer! Optimierung! der! Kodons! konnte! die! Expressionsrate! signifikant! gesteigert!

werden.!Bei!Expressionen!von!FabRFragmenten!wurden!die!Proteine!in!den!Überstand!

sezerniert!und!lagen!als!korrekt!gefaltetes!Heterodimer!in!funktioneller!Form!vor,!was!

durch! ELISARAnalyse! bestätigt! werden! konnte.! ! Durch! affinitätschromatographische!

Verfahren! konnten! bis! zu! 12! mg! des! Zielproteins! aus! 3! l! Kulturvolumen! erhalten!

werden.!!!

Diese! Ergebnisse! belegen,! dass! die! Expression! in! Insektenzellen! eine! ausgezeichnete!

Strategie!darstellt,!um!hohe!Mengen!funktioneller!FabRFragmente!zu!erhalten.!!Gründe!

für!diese!Überlegenheit!gegenüber!anderen!Verfahren!sind!sicher!in!der!im!Vergleich!zu!

höheren! Wirtssystemen! wie! Säugerzellen! erhöhten! Expressionsrate,! der! reduzierten!

Faltungskontrolle,! und! der! Einfachheit! der! Kultivierung! zu! sehen.! So! erleichtert! die!

Abwesenheit!von!Serum!die!nachfolgenden!Reinigungsschritte!signifikant.!Obgleich!eine!

Expression!von!FabRFragmenten!in!Insektenzellen!dokumentiert!ist,!wird!bislang!wenig!

Gebrauch! von! dieser! Strategie! gemacht.! Dies! mag! verwundern,! allerdings! ist! eine!

Realisierung! aufwändiger,! insbesondere! auch! finanziell.! ! Die! im! Rahmen! dieser! Arbeit!

für! unterschiedliche! FabRFragmente! erhaltenen! Ausbeuten! bestätigen! jedoch! die!

allgemeine!Anwendbarkeit.!Damit!eröffnet!das!hier!etablierte!Verfahren!die!Möglichkeit,!

substantielle! Quantitäten! von! FabRFragmenten! darzustellen,! die! in! zukünftigen! und!

derzeit! laufenden! kristallographische! Analysen! hinsichtlich! ihrer! strukturellen!

Besonderheiten!charakterisiert!werden.!!