Antikörperkonstrukte!
5.1.2 Darstellung!als!humane!Fab=Fragmente!
!
Ein! FabRFragment! (fragment* antigen8binding)! bildet! eine! antigenbindende! Einheit,! die!
sich! aus! der! leichten! Immunglobulinkette! (VL)! sowie! der! VHR! und! CH1RDomäne! der!
schweren! Kette! zusammensetzt.! Es! handelt! sich! damit! um! ein! monovalentes!
Bindungsmolekül.! Bleibt! die! Disulfidbrücke! zwischen! den! beiden! AntikörperR Fragmenten! bestehen,! werden! bivalente! F(ab)2RFragmente! generiert.! Durch! die!
Ermittlung!der!Raumstruktur!eines!AntigenRFabRKomplexes!nach!einer!Kokristallisation!
können! detaillierte! Informationen! über! die! Relevanz! einzelner! Aminosäuren! für! die!
Wechselwirkung! beider! Bindungspartner! gewonnen! werden.! Aufgrund! ihrer! starren!
Struktur! eignen! sich! FabRFragmente! besonders! für! eine! Analyse! von! Epitopen.! Dabei!
kristallisieren!sie!aus!und!werden!mit!einer!Röntgenstrukturanalyse!untersucht.!ScFvR Fragmente! (single* chain* variable* fragment),! eine! der! kleinstmöglichen! BindungsR determinierenden!AntikörperREinheit,!sind!für!derartige!Analysen!oft!zu!flexibel.!
Zur! Herstellung! der! FabRFragmente! wurden! drei! verschiedene! Strategien! verfolgt:! die!
proteolytische! Spaltung! von! Vollantikörpern,! sowie! die! prokaryotische! und!
eukaryotische!Expression.!!
Da! hinter! der! Darstellung! rekombinanter! humaner! FabRFragmente! ein! kompliziertes!
wie! auch! zeitR! und! kostenaufwändiges! Ineinandergreifen! verschiedener!
molekularbiologischer! Methoden! wie! der! Entwicklung! geeigneter! KlonierungsR! und!
Expressionsstrategien! steht,! wurde! zur! Produktion! der! FabRFragmente! zunächst! die!
Spaltung! intakter! Immunglobuline! angewendet.! ImmunglobulinRDomänen! sind!per*se!
vergleichsweise! inert! gegen! enzymatische! Spaltungsreaktionen.! Allerdings! können! in!
der! flexiblen!HingeRRegion! des! Antikörpers! mithilfe! der! Cysteinpotease! Papain! (die!
Frucht! Papaya! enthält! hohe! Konzentrationen! des! Enzyms)! AminosäureRVerbindungen!
aufgetrennt!werden.!Zur!Darstellung!von!FabRFragmenten!erfolgte!die!PapainRSpaltung!
von! jeweils! einem! Milligramm! gereinigtem! Antikörper.! Dabei! wurde! die! enzymatische!
Spaltungsdauer!variiert.!Durch!die!Verlängerung!der!Inkubationszeit!von!4!Stunden!auf!
6! Stunden! wurde! der! Anteil! an! ungespaltenem! IgGRAntikörper! deutlich! verringert,!
allerdings! zeigte! die! Analyse! im! Immunoblot! bereits! bei! einer! Inkubationszeit! von! 4!
Stunden! eine! unerwünschte! Fragmentierung! des! Antikörpers.! Um! Nebenprodukte! aus!
der! Probe! zu! entfernen,! wurde! an! die! Reinigung! mittels!κRspezifischer! Matrix! eine!
Aufreinigung! über! Protein! A! angeschlossen.! Durch! dieses! Vorgehen! konnte! die!
Konzentration! unerwünschter! Nebenprodukte! deutlich! reduziert! werden.!
Zusammenfassend!war!jedoch!die!Ausbeute!des!FabRFragmentes!aufgrund!der!Bildung!
der! Nebenprodukte! zu! gering! und! der! Aufwand! bedingt! durch! aufeinanderfolgende!
Reinigungsschritte! vergleichsweise! hoch.! Eine! präparative! Darstellung! würde!
außerordentlich! hohe! Mengen! von! IgG! erfordern,! was! eine! Anwendung! als! generelle!
Strategie!als!unrealistisch!erscheinen!lässt.!Aus!diesem!Grunde!erfolgte!als!alternative!
Strategie!eine!Reklonierung!der!Antikörper!in!das!FabRFormat.!!
Der! Vorteil! einer! FabRExpression! im! prokayotischen! System! liegt! in! einer! ZeitR! und!
Kostenersparnis.! Zur! Darstellung! eines! FabRFragmentes! im! prokaryotischen! System!
wurde! das! StarGateRFusionsklonierungssystem! von! IBA*BioTAGnology! verwendet.!
Dieses! System! erlaubt! in! drei! aufeinander! folgenden! Reaktionsschritten! eine!
Assemblierung!der!VHCH1R!und!VLCLRSequenzen!in!den!gewünschten!Expressionsvektor.!
Obgleich!die!FabRExpression!in!Bakterien!ein!fest!etabliertes!Verfahren!darstellt,!lieferte!
die! initiale! Expression! des! Antikörperfragmentes! hier! nur! eine! geringe! Ausbeute.! Zur!
Optimierung! der! Darstellung! des! FabRFragmentes! wurden! anschließend!
unterschiedliche! Expressionsbedingungen! geprüft.! Zudem! wurde! neben! dem!
periplasmatischen!Extrakt!auch!der!Gesamtzellextrakt!gewonnen!und!das!FabRFragment!
mittels! Reinigung! über! NiRNTARMatrix! isoliert.! Die! anschließende! SDSRPAGERAnalyse!
zeigte,! dass! lediglich! in! den! Fraktionen! des! Gesamtzellextraktes! das! FabRFragment!
detektiert!werden!konnte.!Die!Expression!über!Nacht!bei!30!°C!und!220!rpm!lieferte!die!
höchste! Ausbeute,! welche! jedoch! noch! weiter! optimiert! werden! müsste.! Die!
nachfolgende! ELISARAnalyse! des! dargestellten! FabRFragmentes! ergab! eine! signifikante!
Reaktivität! mit! Phl!p!5a! und! bestätigte! die! erfolgreiche! Darstellung! des! Phl!p!5aR spezifischen!FabRFragmentes.!
Zur!Optimierung!der!prokaryotischen!Expression!könnte!gegebenenfalls!ein!alternativer!
Expressionsvektor!eingesetzt!werden.!Der!verwendete!E.*coliRExpressionsvektor!pASGR IBAR44!besitzt!einen!TetRPromotor,!welcher!in!seiner!Expressionsstärke!nicht!mit!dem!
starken! T7RPromotor! vergleichbar! ist.! Zudem! zeigte! die! SDSRPAGERAnalyse,! dass! aus!
dem! periplasmatischen! Raum! kein! FabRFragment! isoliert! werden! konnte.! Dies! deutet!
auf! eine! fehlerhafte! Translokation! des! Antikörperfragmentes! hin.! Eine! andere!
Signalsequenz! könnte! sich! daher! positiv! auf! die! funktionelle! Expression! des! FabR Fragmentes! auswirken.! Die! Expressionskassette! des! Phl!p!5aRspezifischen! FabR Konstruktes!in!pASGRIBAR44!enthält!NRterminal!von!der!VHRSequenz!eine!OmpAR!und!NR
terminal! von! der! VLRSequenz! eine! PhoARSignalsequenz.! Diese! bewirken! über! das! SecR System! (Sec,! secretion)! von! E.*coli! die! posttranslationale! ProteinRtranslokation.! In!
Studien! konnte! gezeigt! werden,! dass! die! Verwendung! von! SRPRSignalsequenzen! (SRP,!
signal* recognition* particle)! eine! bis! zu! 700fache! Steigerung! der! Translokation!
ermöglichen! (Steiner!et*al.,! 2006).! Im! Gegensatz! zu! dem! SecRSystem! vermitteln! SRPR Signalsequenzen!eine!kotranslationale!Zielsteuerung!der!Proteine.!Insgesamt!erscheint!
jedoch!die!prokaryotische!Expression!als!schwierig.!Auch!inwieweit!die!hier!erhaltenen!
Proteine!von!homogener!Qualität!sind,!was!jedoch!von!entscheidender!Bedeutung!wäre,!!
ist!auf!der!Grundlage!der!hier!erhaltenen!Daten!kaum!zu!beurteilen.!!
Als! zielführendste! Strategie! stellte! sich! jedoch! die! Expression! in! eukaryotischen! Sf9R Insektenzellen! heraus.! Hierzu! erfolgte! u.a.! eine! Optimierung! des! zugrundeliegenden!
Expressionsvektors.! Dieser! verfügte! anfänglich! über! zwei! identische! gp67R Signalsequenzen.! Durch! die! Modifikation! einer! der! beiden! gp67RSequenzen! in! Form!
einer! Optimierung! der! Kodons! konnte! die! Expressionsrate! signifikant! gesteigert!
werden.!Bei!Expressionen!von!FabRFragmenten!wurden!die!Proteine!in!den!Überstand!
sezerniert!und!lagen!als!korrekt!gefaltetes!Heterodimer!in!funktioneller!Form!vor,!was!
durch! ELISARAnalyse! bestätigt! werden! konnte.! ! Durch! affinitätschromatographische!
Verfahren! konnten! bis! zu! 12! mg! des! Zielproteins! aus! 3! l! Kulturvolumen! erhalten!
werden.!!!
Diese! Ergebnisse! belegen,! dass! die! Expression! in! Insektenzellen! eine! ausgezeichnete!
Strategie!darstellt,!um!hohe!Mengen!funktioneller!FabRFragmente!zu!erhalten.!!Gründe!
für!diese!Überlegenheit!gegenüber!anderen!Verfahren!sind!sicher!in!der!im!Vergleich!zu!
höheren! Wirtssystemen! wie! Säugerzellen! erhöhten! Expressionsrate,! der! reduzierten!
Faltungskontrolle,! und! der! Einfachheit! der! Kultivierung! zu! sehen.! So! erleichtert! die!
Abwesenheit!von!Serum!die!nachfolgenden!Reinigungsschritte!signifikant.!Obgleich!eine!
Expression!von!FabRFragmenten!in!Insektenzellen!dokumentiert!ist,!wird!bislang!wenig!
Gebrauch! von! dieser! Strategie! gemacht.! Dies! mag! verwundern,! allerdings! ist! eine!
Realisierung! aufwändiger,! insbesondere! auch! finanziell.! ! Die! im! Rahmen! dieser! Arbeit!
für! unterschiedliche! FabRFragmente! erhaltenen! Ausbeuten! bestätigen! jedoch! die!
allgemeine!Anwendbarkeit.!Damit!eröffnet!das!hier!etablierte!Verfahren!die!Möglichkeit,!
substantielle! Quantitäten! von! FabRFragmenten! darzustellen,! die! in! zukünftigen! und!
derzeit! laufenden! kristallographische! Analysen! hinsichtlich! ihrer! strukturellen!
Besonderheiten!charakterisiert!werden.!!