Cristae Junctions sind häufig parallel zur Wachstumsebene ausgerichtet

Um eine solche vermutete, von der Ausrichtung zur Wachstumsebene abhängige Anordnung beobachten zu können, muss die Ausrichtung der Mitochondrien im Schnitt (der für die elektronenmikroskopische Aufnahme nötig ist) bekannt sein. Daher wurde die Ausrichtung der Cristae Junctions in Tomogrammen von Schnitten, die parallel zur Wachstumsebene angefertigt wurden, untersucht.

Zu diesem Zweck wurden primäre, humane Fibroblasten auf Aclar-Plättchen angezogen und bei einer Konfluenz von ca. 90% schonend fixiert. Nach einer zusätzlichen Fixierung folgten die üblichen Kontrastierungs- und Dehydrierungs-Schritte (s. Material und Methoden) und die Zellen wurden in Epon (Agar 100) eingebettet. Die eingebetteten Zellen wurden nun streng parallel zur vorherigen Wachstumsebene in 250 nm dicke Schnitte zerteilt und nachkontrastiert. Die Dicke der Schnitte ermöglichte es somit, dass ein gesamter mitochondrialer Tubulus in das Volumen des Schnittes passte und war gleichzeitig dünn genug, um in dem verwendeten Transmissionselektronenmikroskop (Philips CM120) vom Elektronenstrahl durchdrungen werden zu können. Die Schnitte wurden in Saxton-Intervallen von -64,5° bis +64,5° im Mikroskop gedreht und aufgenommen. Um eine möglichst isotrope laterale Auflösung zu erreichen, wurden die Schnitte jeweils zweimal, um 90° gedreht, aufgenommen. Ein Beispiel einer solchen tomographischen Aufnahme eines Mitochondriums, die in Zusammenarbeit mit Dietmar Riedel (Facility für Elektronenmikroskopie, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie) erstellt wurde, ist in Abb. 3.21 gezeigt.

78 Abb. 3.21 Cristae Junction-Ausrichtung und Cristae-Morphologie in primären, humanen Fibroblastenmitochondrien, analysiert durch zwei-Achsen Elektronen-Tomographie (Jans et al., 2013).

(A und B) Eine einzelne Ebene des Tomogramms (grau) wurde überlagert mit einer Rekonstruktion der segmentierten Cristae Membranen (grün). Cristae Junctions sind durch orange Kugeln markiert. In (A) ist eine Aufsicht auf das Mitochondrium (das Tomogramm ist in einer Ebene mit der Wachstumsebene) und in (B) eine Seitenansicht desselben Mitochondriums zu sehen. Die lamellaren Cristae sind durch Cristae Junctions an den beiden Seiten des Organells (parallel zur Wachstumsoberfläche) mit der inneren Grenzflächenmembran verbunden. (C) Vergrößerung einer einzelnen Ebene des Tomogrammes (Aufsicht). Die Pfeile kennzeichnen dieselben Cristae Junctions die in (A) mit Pfeilen markiert sind. (Größenbalken: 100 nm in A und C; 50 nm in B)

79 Die Cristae in den Mitochondrien der primären, humanen Fibroblasten weisen eine lamellare Struktur auf und sind großenteils senkrecht zur Längsrichtung des Mitochondriums ausgerichtet (Abb. 3.21). Vor allem zeigte sich aber, dass die Cristae Junctions in diesen Mitochondrien vorwiegend parallel zur Wachstumsebene angeordnet sind (Abb. 3.21). Auch in weiteren Aufnahmen wurden kaum Cristae Junctions gefunden, die nicht diese Ausrichtung aufwiesen. Dabei wurde darauf geachtet, dass in den analysierten Tomogrammen das gesamte Mitochondrium abgebildet war und nicht nur ein Ausschnitt.

Dennoch musste eine mögliche Fehlerquelle dieser Analyse in Betracht gezogen werden: So haben die hier erstellten Tomogramme eine schlechtere axiale Auflösung, da für die Rekonstruktion der Tomogramme nur elektronenmikroskopische Aufnahmen der Schnitte in den Winkeln von -64,5° bis +64,5° gemacht werden konnten (bei einem steileren Winkel kann der Elektronenstrahl die Probe nicht mehr durchdringen). Daher fehlen die Aufnahmen in den Winkeln von +/-64,5° bis +/-90°, die für eine optimale Rekonstruktion notwendig wären. Dies könnte die Identifizierung möglicher Cristae Junctions im oberen und unteren Teil des Tomogrammes möglicherweise verhindern. Daher wurden zusätzlich

Abb. 3.22 Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten primärer, humaner Fibroblasten, die senkrecht (A) bzw. parallel (B) zur Wachstumsebene geschnitten und aufgenommen wurden. In den vergrößerten Ausschnitten sind jeweils Mitochondrien gezeigt, die in den senkrechten Schnitten bevorzugt rund (A) und in parallelen Schnitten bevorzugt länglich (B) aussahen. (Größenbalken: 1 µm in den großen Bildern; 200 nm in den vergrößerten Ausschnitten)

80 zwei-dimensionale elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten aus primären, humanen Fibroblasten parallel zur Wachstumsebene (wie im Tomogramm) und senkrecht zur Wachstumsebene erstellt (Abb. 3.22).

Das Erscheinungsbild der Mitochondrien hängt in der zwei-dimensionalen elektronenmikroskopischen Aufnahme stark von der Betrachtungsrichtung ab:

Mitochondrien, die parallel zur Wachstumsebene und damit in der Längsebene angeschnitten wurden, sehen in der elektronenmikroskopischen Aufnahme bevorzugt länglich (tubulär) aus (Abb. 3.22 B), während senkrecht angeschnittene Mitochondrien rund aussehen (Abb. 3.22 A). Somit ist für eine elektronenmikroskopische, ultrastrukturelle Untersuchung der Mitochondrien im Kontext der Zelle, eine klar definierte Ausrichtung im Schnitt notwendig.

Um das oben angesprochene Problem der möglicherweise technisch bedingten Fehl-interpretation der tomographischen Daten zu adressieren, wurden eine Vielzahl der in Abb. 3.22 A gezeigten senkrecht angeschnittenen Mito-chondrien, im Hinblick auf die Ausrichtung der Cristae Junctions, relativ zur Wachstumsoberfläche, untersucht. Dabei zeigte sich – in Übereinstimmung mit den Elektronen-Tomographie-Daten (vgl.

Abb. 3.21) – eine bevorzugte Ausrichtung der Cristae Junctions an den beiden Seiten der Mitochondrien (83% der Cristae Junctions zeigten eine solche Abb. 3.23 Analyse der Ausrichtung von Cristae Junctions

in senkrecht zur Wachstumsoberfläche angefertigten elektronenmikroskopischen Schnitten. Die meisten der Cristae Junctions sind in Übereinstimmung mit den Tomographie-Daten (Abb. 3.21) parallel zur Wachstumsebene ausgerichtet.

81 Ausrichtung), die parallel zur Wachstumsoberfläche liegen (Abb. 3.23).

Insgesamt konnte somit gezeigt werden, dass Mitofilin als Kern-Komponente des MINOS-Komplexes in den Bereichen der Cristae Junctions angereichert ist. Die Kern-MINOS-Komponenten bilden keine erweiterten, zusammenhängenden Strukturen, sondern sind alle – in unterschiedlicher Zusammensetzung – in denselben distinkten Clustern lokalisiert, welche einen Dichtegradienten vom Zentrum zum Rand der Zelle hin aufweisen. Andere Interaktionspartner des MINOS-Komplexes haben eine gänzlich unterschiedliche Lokalisation. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die horizontale Ausrichtung der MINOS-Cluster in einer Art „Strickleiter“-Anordnung ein allgemein in den Mitochondrien von adhärenten Säugerzellen zu beobachtendes Phänomen ist, was eine generelle organisierte Ausrichtung der Cristae Junctions in all diesen Zellen impliziert.

Durch Elektronentomographie konnte gezeigt werden, dass die Cristae in den Mitochondrien humaner Fibroblasten meist eine lamellare Struktur haben, die über Cristae Junctions, die in der Regel parallel zur Wachstumsoberfläche angeordnet sind, mit der inneren Grenzflächenmembran verbunden sind. Daraus kann geschlossen werden, dass der Kern-MINOS-Komplex in Mitochondrien von kultivierten Säugerzellen in gleichmäßig angeordneten, diskreten Clustern an Cristae Junctions lokalisiert und parallel zur Wachstumsoberfläche angeordnet ist.

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