Computergestützte Transkriptionsstart- und Promotor-Bestimmung

Ergebnisse

Abbildung 4.16: Expression von HOXA10 und HOXA11 in DEX- (A) und P-behandelten (B) MMZ.

RT-PCR-Analysen aller oben genannter Gene erfolgte mit Hilfe spezifischer Oligonukleotide an MMZ cDNA (siehe Kapitel 4.2.2.6).

Ergebnisse

Transkriptionsstartstellen und Promotorbereiche mit einem TATA-Box Element vorhergesagt werden (Zhang et al 1999, und eigene Daten). Aber nur eine der ermittelten möglichen Transkriptionsstartstellen inklusive TATA-Box lag an einer Stelle in der Sequenz, die zusammen mit dem bekannten 3'-Ende einen Bereich von ungefähr 8 kb umspannt. Bei der Länge dieses Bereiches handelt es sich exakt um die Größe des nachgewiesenen PLZF-Transkriptes. Der vorhergesagte Transkriptionsstart befand sich an der Position -5979 relativ zur Translationsstartstelle.

4.6.2 5'-RACE

Um die vorhergesagte Transkriptionsstartstelle (siehe Kapitel 4.6.1) experimentell zu bestätigen, wurde ein 5'-RACE (rapid amplification of cDNA ends) durchgeführt. Hierzu wurde ein 5'-RACE Kit (Roche) nach dem Protokoll des Herstellers verwendet (siehe Kapitel 3.3.8). Die Erststrangsynthese erfolgte nicht wie sonst üblich durch ein Oligo(dT)-Oligonukleotid, da eine schlechte Amplifizierungseffizienz der cDNA aufgrund der 8 kb Gesamtlänge zu erwarten war.

Die Erststrangsynthese erfolgte parallel an Gesamt-RNA aus KG-1-Zellen und MMZ unter Verwendung eines sequenzspezifischen Oligonukleotides, das ungefähr 400 bp stromabwärts der vorhergesagten Transkriptionsstartstelle liegt. Die anschließenden beiden PCR-Reaktionen mit KG-1-cDNA erfolgten nach Angaben des Herstellers mit einer TaqPolymerase von Promega, und es konnte ein 150 bp großes Fragment in den pGEM-T^®-Vektor kloniert werden. Für die MMZ-cDNA musste das PCR-Programm optimiert werden, um eine distinkte Bande zu erhalten.

Nach Einsatz von Biotherm TaqPolymerase (Genecraft) und einem modifizierten PCR-Programm (s.u.), konnte ein ungefähr 110 bp großes Fragment amplifiziert und kloniert werden.

PCR-Programm für MMZ-cDNA:

1. 94^oC für 2 min 2. 94^oC für 15 sek 3. 58^oC für 30 sek 4. 72 ^oC für 1 min 5. 2.-4. 35 Zyklen 6. 72 ^oC für 7 min

Ergebnisse

5'-Ende des PLZF-Transkriptes identifiziert werden. Der Transkriptionsstart des PLZF-Gens konnte somit in KG-1 Zellen an der Position -5858 und in MMZ an Position -5801 relativ zum Translationsstart festgelegt werden (Abb. 4.17).

SP1 ATG

SP3 SP2

KG-1

-5858

MMZ

-5801

5' +1 3'

-5979 TATA

vorhergesagte Startstelle

Abbildung 4.17: Bestimmung der Transkriptionsstartstelle des PLZF-Gens.

Das 5'-RACE wurde mit KG-1- und MMZ-RNA durchgeführt. Die Erststrangsynthese erfolgte mit Hilfe des sequenzspezifischen Oligonukleotides SP1, die anschließenden PCRs mit Oligonukleotiden SP2 und SP3.

4.7 Klonierung des PLZF-Promotors

Die genomische Struktur des PLZF-Gens, das sich auf dem langen Arm des Chromosom 11 an der Stelle 11q23 befindet, ist weitgehend aufgeklärt (Zhang et al 1999) und die Gen-Sequenz sowie der 5'-Bereich in der Genbank verfügbar (Zugang: AF060568). Es ist bisher jedoch nicht gelungen, den Promotor zu klonieren und seinen Einfluss auf die Regulation der PLZF-Expression zu untersuchen. Dies war ein Ziel dieser Arbeit.

Die 5'-flankierende Region des PLZF-Gens war im Rahmen dieser Arbeit durch ein 5'-RACE identifiziert worden (siehe Kapitel 4.6.2). Daraufhin konnten mit Hilfe einer PCR-Strategie aus genomischer DNA vier verschieden lange Bereiche (zwischen 0,6 und 4,1 kb) der möglichen Promotorregion des PLZF-Gens amplifiziert und in pGL3-Basic kloniert werden (Abb. 4.18).

Durch diese Verknüpfung von möglichen Promotorbereichen mit einem Reportergen, hier das Luziferase-Gen, ist eine Untersuchung ihrer Bedeutung für die Transkription in einer transienten Transfektion möglich. Das Vorgehen der Klonierung wurde in Kapitel 3.3.10 beschrieben. Die vier klonierten Promotorkonstrukte wurden durch automatische Sequenzierung überprüft. Dabei zeigte sich, im Vergleich zur veröffentlichten genomischen Sequenz von PLZF, in allen vier Sequenzen ein Nukleotidaustausch von G zu T an der Position -6054 relativ zum Start-ATG.

Dies lässt auf einen Polymorphismus in der genomischen DNA, aus der die Fragmente amplifiziert worden sind, schließen. Da sich der Nukleotidaustausch im Bereich der 5'-UTR

Ergebnisse

befindet und somit voraussichtlich keine z.B. für die Transkriptionsinitiation wichtigen Elemente betrifft, wurde diese Mutation nicht weiter verfolgt.

In dem klonierten PLZF-Promotorbereich konnten mit Hilfe von Computerprogrammen wie das TFSEARCH-Programm (http://molsun1.cbrc.aist.go.jp/research/db/TFSEARCH.html) oder die AliBaba 2.1-Software (http://wwwiti.cs.uni-magdeburg.de/~grabe/alibaba2) und das TRANSFAC-System (http://transfac.gbf.de) mögliche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren ermittelt werden. Eine Auswahl der für diese Arbeit interessanten Bindungsstellen wie GR und C/EBPb ist in Abbildung 4.18 aufgeführt.

-5750 -9825

4,1 kb luc

| |

-7935

2,2 kb

| luc

-6888

1,1 kb

| luc

-6368 0,6 kb

| luc 5’

GR C/EBPß

GR Exon 1 5’-UTR

|

-5858

3’

PLZF-6368/luc3 PLZF-7935/luc3 PLZF-9825/luc3

PLZF-6888/luc3

Abbildung 4.18: Struktur der PLZF-Promotorkonstrukte.

Verschieden lange 5'-flankierende Regionen von PLZF (schwarze Linien) und ein Stück von Exon 1 (grauer Kasten), das sich 3' von der Transkriptionsstartstelle erstreckt, wurden in pGL3-Basic vor ein Luziferase-Reportergen (luc) kloniert. Die angegebenen Positionen beziehen sich auf Basenpaare relativ zum Start-ATG. Computergestützt lokalisierte Bindungsstellen für GR und C/EBPb sind eingezeichnet.

4.8 Transfektionsstudien des PLZF-Promotorbereiches

Um die Bedeutung des möglichen PLZF-Promotorbereiches für die Expression des Gens zu untersuchen, wurden Teile des Promotors vor ein Reportergen kloniert (Abb. 4.18). Mittels transienter Transfektion wurden diese Promotorkonstrukte in kultivierten Zellen übertragen. Für Jurkat-Zellen eignete sich dazu am besten die Methode der Elektroporation, für die adhärenten

Ergebnisse

4.8.1 Einfluss von GR auf die PLZF-Promotoraktivität

Aufgrund der im Northern Blot und in RT-PCR-Analysen identifizierten Induktion der PLZF-Expression durch DEX (Abb. 4.3-4.10) sollte zunächst der Einfluss von DEX auf den möglichen PLZF-Promotor bestimmt werden. Hierzu wurden ESZ mit den vier Promotorkonstrukten (PLZF-6368/luc3, PLZF-6888/luc3, PLZF-7935/luc3 und PLZF-9825/luc3) transfiziert und einem Expressionskonstrukt für GRa (pcDNA/GRa) kotransfiziert sowie eine DEX-Behandlung durchgeführt. Als Kontrollen dient der pGL3-Basic-Vektoren, in dem ein GR-responsives Element vor einem Minimalpromotor liegt (GRE-32wt/luc3) (Abb. 4.19). Das Kontrollplasmid wurde nach Kotransfektion mit dem Transkriptionsfaktor GRa sehr stark induziert. Zusätzlich zur Kotransfektion mit GRa musste auch eine Stimulation mit DEX erfolgen, um die hohe Induktion zu erreichen. Bei den vier PLZF-Promotorkonstrukten hingegen war durch Kotransfektion des Rezeptorexpressionskonstruktes und anschließender Stimulation mit DEX keine Aktivierung des Reportergens möglich.

Abbildung 4.19: Transfektionsanalyse der PLZF-Promotorkonstrukte in ESZ.

ESZ wurden mit den vier PLZF-Promotorkonstrukten (siehe Abb. 4.18) unter Verwendung der Kalziumphosphat-Präzipitationsmethode transfiziert und ein Leervektor sowie ein Expressionsvektor für GRa kotransfiziert. 20 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 Stunden mit 250 nM DEX behandelt oder unbehandelt belassen und danach die Luziferaseaktivität in relativen Lichteinheiten (RLE) gemessen.

Ergebnisse

Der gleiche Versuchsansatz wie in ESZ wurde daraufhin in einem anderen Zellsystem, mit Jurkat-Zellen, durchgeführt, um Aufschluss über eine mögliche zelltypspezifische Regulation des PLZF-Promotors zu erhalten. Auch hier konnte im Vergleich zu den erfolgreichen Kontroll-plasmidversuchen gezeigt werden, dass trotz Kotransfektion des Expressionskonstruktes für GRa und Behandlung mit DEX in keinem der vier Promotorkonstrukte die Transkription des Reportergens aktiviert wurde (Abb. 4.20). Die Anwesenheit von DEX war als Einfluss auf die Promotoraktivität unerheblich, es erfolgte keine ligandenabhängige Aktivierung der PLZF-Promotorkonstrukte.

Abbildung 4.20: Transfektionsanalyse der PLZF-Promotorkonstrukte in Jurkat-Zellen.

Jurkat-Zellen wurden, analog zu der Transfektion in Abb. 4.19, mit den vier PLZF-Promotorkonstrukten (siehe Abb. 4.18) durch Elektroporation transfiziert und ein Leervektor bzw. ein Expressionsvektor für GRa kotransfiziert. 20 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 Stunden mit 250 nM DEX behandelt oder unbehandelt belassen und danach die Luziferaseaktivität in relativen Lichteinheiten (RLE) gemessen.