2. Patienten und Methoden
2.8 Computereinstellungen und Messung der Proben
2.7.4 Permeabilitätskontrolle
Die Permeabilitätskontrolle dient der Kontrolle, ob das Einbringen von Löchern in die T-Zellen mit der Permeabilisierungslösung korrekt durchgeführt wurde.
Die Kontrollprobe wird in der Aufarbeitungshase mit der gleichen Menge an PMA und Ionomycin stimuliert wie die eigentlichen Proben auch und erhält ebenfalls BFA. In den aktivierten T-Zellen wird nun unter anderem der CD69-Rezeptor produziert, der aber nicht an der Zelloberfläche exprimiert werden kann, da er durch BFA an den Golgiapparat gebunden vorliegt. Der Permeabilitätskontrolle wird gleichzeitig mit den Proben in einem späteren Aufarbeitungsschritt Permeabilisierungslösung zugeführt, die Löcher in die Membranen der Zellen reißt. Durch diese Membrandefekte können nun CD69PE-Fluoreszenzantikörper in die Zelle eindringen und die CD69-Rezeptoren am Golgiapparat markieren.
Im Dot Plot ist auf der Abszisse die Fluoreszenzintensität für CD3PerCP und auf der Ordinate für CD69PE aufgetragen. Sind mehr als 90% der T-Zellen CD69-positiv, so sind die Proben korrekt permeabilisiert worden.
2.7.5 Die zu untersuchenden Proben
Sind alle Kontrollen zur Testung der eingesetzten Reagenzien positiv, so folgt die eigentliche Probentestung. Auf der Abszisse des Dot Plots der gemessenen Proben ist, wie bei den Kontrollen auch, die Fluoreszenzintensität für CD3PerCP dargestellt. Auf der Ordinate ist für jede Probe speziell die Fluoreszenzintensität des PE-gebundenen-Zytokinantikörpers aufgetragen, mit dem die Probe markiert wurde. Jedem Patienten werden mehrere Dot Plots von stimulierten Proben zugeordnet, mit denen der prozentuale Anteil an T-Lymphozyten bestimmt werden soll, die jeweils ein bestimmtes Zytokin produziert haben.
1. Zu Beginn der Messungen wird als erstes, nachdem der Computer angeschaltet wurde, das Analyseprogramm CellQuest gestartet.
2. Es wird die Darstellungsgrafik Dot Plot ausgewählt, woraufhin in dem geöffneten Fenster 5 Dot Plots erscheinen. Diese sind wie folgt definiert:
Im ersten Dot Plot werden die Lymphozyten von den anderen gemessenen Zellen mit einem Gate markiert, wodurch die anderen Zellen in der weiteren Auswertung nicht mehr berücksichtigt werden (siehe 2.6.1.).
Im zweiten Dot Plot wird die Wolke der T-Lymphozyten markiert, wodurch nur noch diese in der weiteren Analyse berücksichtigt werden (siehe 2.6.1.).
Die Dot Plots 3-5 werden in den verschieden Messungen der Kontrollen und Proben mit unterschiedlichen Markern zur Bestimmung der intrazellulär gebundenen Fluoreszenzantikörper versehen und teilen sich in 4 Quadranten ein.
Tabelle 3: Einstellung der Dot Plots
Abszisse Ordinate
1. Dot Plot FSC SSC
2. Dot Plot FL3 SSC
3. Dot Plot FL1 FL2
4. Dot Plot FL1 FL3
5. Dot Plot FL2 FL3
3. In der Menüleiste wird das Feld Aquire geöffnet und über den Befehl Connect to Cytometer der Computer mit dem Zytometer verbunden.
4. Wieder über Aquire geht man auf das Unterfeld Parameter Description. Hier wird das Speichermedium und der Dateiname bestimmt.
5. Damit die Detektoren des Lasers, die das Lichtsignal in elektronische Signale umwandeln, mittels der Software bezüglich Stromstärke und Spannung optimal für diese Messung eingestellt sind, muss folgender Schritt durchgeführt werden: In der Menüleiste über das Feld Cytometer das Unterfeld Detectors/Amps auswählen und dort die Parameter aus folgender Tabelle einstellen:
Tabelle 4: Einstellung der Detektoren des Lasers
Parameter Detector Voltage AmpGain Mode
P1 FCS E00 2.63 Lin
P2 SSC 534 1.00 Lin
P3 FL1 831 1.00 Log
P4 FL2 818 1.00 Log
P5 FL3 821 1.00 Log
6. Über Cytometer in der Menüleiste wird das Unterfeld Threshold ausgewählt und der Thresholdwert 52 eingegeben. Mit dieser Angabe wird der untere Schwellenwert für die FSC-Datenerkennung festgelegt, der dazu dient, Störfaktoren wie Zelltrümmer, die einen kleineren Thresholdwert haben als angegeben, aus der Event-Erkennung fernzuhalten.
7.
Wieder über Cytometer wird das Feld Compensation geöffnet. Bei zwei oder drei ver-wendeten Fluoreszenzfarbstoffen in einer Messung kann es bei überschneidenden Wellenlängenspektren zu Verstärkungen der Signale in diesen Bereichen kommen, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Zur Korrektur werden die Überschneidungen einfach von einander abgezogen. Die Werte dafür werden in diesem Fenster eingegeben und betragen für unseren Versuchsaufbau:FL1- 1,0% FL2 FL2- 21,6% FL1 FL2- 0,0% FL3 FL3- 23,8% FL2
2.8.2 Geräteeinstellung
Nachdem die allgemeinen Computereinstellungen durchgeführt wurden, beginnt die Auswertung der Proben und Kontrollen mit der Geräteeinstellung.
1. Über Aquire in der Menüleiste wird das Fenster Edit Panel angeklickt. Da die fünf Proben für die Geräteeinstellung immer in gleicher Reihenfolge gemessen werden, wird hier ein festes Messschema eingegeben und abgespeichert, das für die nachfolgenden Messungen einfach wieder aufgerufen werden kann.
Tabelle 5: Computereinstellung zur Messung der Geräteeinstellung
Name der Probe P1 P2 P3 P4 P5
1. Röhrchen ohne Fluoreszenz FSC SSC
2. Röhrchen Isotypenkontrolle FSC SSC IgGγ2aFITC IgGγ2aPE CD3 PerCP 3. Röhrchen CD3 FITC FSC SSC CD3 FITC CD3 PE CD3 PerCP
4. Röhrchen CD3 PE FSC SSC CD3 FITC CD3 PE CD3 PerCP
5. Röhrchen CD3PerCP FSC SSC CD3 FITC CD3 PE CD3 PerCP
2. Das erste Falconröhrchen wird nun unter den Ansaugstutzen gesetzt und die Messung gestartet. Dieser Probe wurde kein Fluoreszenzfarbstoff zugegeben und ist entsprechend auch nur im ersten Dot Plot zu bewerten, nämlich nach SSC und FSC. In der Grafik erscheinen die Wolken der verschieden Leukozytengruppen. Um die Punktwolke der Lymphozyten wird das Gate gesetzt und somit die anderen Zellgruppen aus der weiteren Bewertung ausgeschlossen.
Danach wird das Ergebnis abgespeichert.
3. Ist die erste Messung abgeschlossen, wird das Röhrchen mit der Isotypenkontrolle zur Messung in die Vorrichtung eingesetzt. Als zweite Probe wird sie entsprechend im zweiten Dot Plot dargestellt und dient der Verhinderung von Streufluoreszenzen von Seiten der eingesetzten Antikörper.
4. Im Anschluss werden nacheinander die drei Proben in den Falconröhrchen drei bis fünf gemessen, denen jeweils ein Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt wurde. Sie finden entsprechend in den Dot Plots 3 bis 5 Darstellung und dienen der Optimierung der Einstellung der Fluoreszenzkanäle.
2.8.3 Aktivierungskontrolle
1. Vor der ersten Messung muss auch für die Aktivierungskontrolle, genau wie für die Geräteeinstellung ein Messschema erstellt werden. In der Menüleiste wird wieder über das Feld Aquire das Unterfeld Edit Panel geöffnet und folgende Parameter eingegeben:
Tabelle 6: Computereinstellung zur Messung der Aktivierungskontrolle
Name der Probe P1 P2 P3 P4 P5
1.Röhrchen Aktivierungskontrolle FSC SSC FL1 CD69PE CD3PerCP
2. Danach kann die Kontrollprobe gemessen und abgespeichert werden.
2.8.4 Permeabilitätskontrolle
1. Für die Permeabilitätskontrolle muss ebenfalls vor der ersten Messung ein Panel erstellt werden über Edit Panel.
2. Anschließend können die beiden Kontrollen nacheinander gemessen und gespeichert werden.
Tabelle 7: Computereinstellung zur Messung der Permeabilitätskontrolle
Probenname P1 P2 P3 P4 P5
1.Röhrchen Unstimulierte Permkontrolle FSC SSC FL1 CD69PE CD3PerCP 2.Röhrchen Stimulierte Permkontrolle FSC SSC FL1 CD69PE CD3PerCP
2.8.5 Messung der Proben
1. Auch vor der Probenmessung muss ein Panel über Edit Panel erstellt werden.
2. Nun folgt für jede Probe einzeln die Messung und das Abspeichern.
Tabelle 8: Computereinstellung zur Messung der Proben
Probenname P1 P2 P3 P4 P5
1.Röhrchen Isotypenkontrolle FSC SSC IgGγ2aFITC IgGγ2aPE CD3PerCD
2.Röhrchen IL-1 FSC SSC IL-1αPE CD3PerCD
3.Röhrchen IL-2 FSC SSC IL-2PE CD3PerCD
4.Röhrchen IL-8 FSC SSC IL-8PE CD3PerCD
5.Röhrchen IL-10 FSC SSC IL-10PE CD3PerCD