aktive Wachstumsfaktoren wie z.B. BMP-2, ein Protein, das die osteogene Differenzierung fördert, eingebracht werden kann. Die Beherrschung dieses Verfahrens bietet also eine Vielzahl interessanter Anwendungsmöglichkeiten.
Aufbau
Zunächst wurde die Elektrospinnanlage so modifiziert, dass ein Einbau zweier Spritzen gleichzeitig möglich war. Über einen gemeinsamen Stempel kann mit einem Vortrieb ein gleichzeitiges Entleeren beider Spritzen erfolgen. Allerdings ist es hiermit nur möglich, in beiden Spritzen die gleiche Durchflussrate zu verwenden. Eine Alternative besteht in der Verwendung zweier Spritzen mit unterschiedlichen Volumina.
Besser ist jedoch die Verwendung zweier paralleler Stempel, die unabhängig voneinander von peristaltischen Pumpen betrieben werden können.
Der schematische Aufbau des Co-Elektrospinnens ist in Abb. 87 gezeigt.
Abb. 87 Schema des Aufbaus zum Co-Elektrospinnen mit Aufsicht auf die Unterseite einer Spinndüse mit einem Außendurchmesser von 0,6 mm
Ein Problem bei der praktischen Durchführung liegt in der Auswahl der geeigneten Spinndüsengeometrie. Es lässt sich beobachten, dass der Prozess des Co-Elektrospinnens wesentlich schwerer zu kontrollieren ist als das normale Elektrospinnen. So wird
beispielsweise beim Verspinnen nicht mischbarer Flüssigkeiten mitunter die Bildung von
zwei unterschiedlichen Flüssigkeitsstrahlen beobachtet, die dann jeweils homogene Einzelfasern bilden. Auch muss das Verhältnis der Durchflussmengen relativ aufwendig reguliert werden, da bei ungünstigen Verhältnissen nicht sicher ein Taylor-Kegel gebildet wird, aus dem beide Substanzen ineinander zu Fasern versponnen werden können. Es kommt sehr häufig vor, das ein bereits bestehender Spinnprozess durch kleine Instabilitäten gestört wird und damit wieder zur Bildung von Tropfen oder Einzelfasern führt. Im Rahmen der Versuche zur Etablierung des Verfahrens des Co-Elektrospinnens wurde eine Vielzahl von Spinndüsen verwendet. Hierbei bestanden Variationsmöglichkeiten sowohl bei der Länge und Form der ineinander gesteckten Kanülen, als auch bei den Durchmessern und dem Verhältnis der beiden Düsenspitzen. In Abb.88 sind einige der verwendeten Spinndüsen gezeigt.
Abb. 88 Verschiedene zum Co-Elektrospinnen verwendete Spinndüsen
Obwohl eine größere Anzahl verschiedener Spinndüsen verwendet und sowohl die
Durchmesser der Kanülen, der Abstand zwischen den Kanülenspitzen und die Materialien der
reproduzierbaren Spinnvorgang erlaubt hätte. Ebenfalls wurden diverse Polymerlösungen in unterschiedlichen Lösungsmitteln bei verschiedenen Durchflussraten verwendet. Mit Hilfe eines modifizierten Mikroskops wurde dann ein System aufgebaut, das die direkte
Beobachtung des Spinndüse während des Spinnvorganges erlaubte. Erste Untersuchungen mit angefärbten Poly(ethylenoxid)lösungen in Wasser zeigten, das es oftmals durch kleine
Störungen zur Unterbrechung des gleichmäßigen Spinnvorgangs kommt. Mit diesem Aufbau ist allerdings nun eine weitere Voraussetzung für eine bessere Beobachtung und in der Folge auch eine bessere Steuerung vorhanden. Die folgende Bilderserie zeigt einen Spinnvorgang, bei dem als Hülle Poly(ethylenoxid) in Wasser und als Kern dasselbe Material mit einer Anfärbung durch Methylenblau verwendet wurde. In diesem Fall war der Spinnvorgang über den Zeitraum von ungefähr einer Minute stabil.
.
t=0 s t = 5s
t = 10 s t= 35 s
Abb. 89 Stabiler Spinnvorgang einer Poly(ethylenoxid)lösung in Wasser
Zu bemerken ist allerdings, dass trotz des relativ stabilen Taylor-Konus in dem abgebildeten Fall keine einheitlichen Fasern erhalten wurden.
Viel häufiger ist allerdings das Verhalten, wie es in Abb. 90 zu sehen ist: nach kurzer Zeit wird der Spinnvorgang instabil und es werden keine gleichmäßigen Fasern mehr erhalten.
Verwendet wurde das gleiche System wie in Abb. 89.
t= 0 s t= 0 s
t= 5 s t= 7 s
Abb. 90 Instabiler Spinnvorgang einer Poly(ethylenoxid)lösung in Wasser
Trotz der angesprochenen Probleme gelang es jedoch, aus einigen Systemen interessante Fasermorphologien herzustellen.
Modell Poly(styrol) / Poly(ethylenoxid)
Das Verspinnen einer Kombination von Lösungen von Polystyrol und Poly(ethylenoxid) in Dichlormethan führte zur Bildung von Fasern mit Kern-Schale-Strukturen. Die dabei entstehenden Strukturen sind in Abb. 91 gezeigt. Die Abbildung zeigt
transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von einzelnen Faserabschnitten. Es war zu beobachten, das sowohl die Faserdicke als auch die Fasernmorphologie während des Spinnvorgangs variierte, so dass keine einheitlichen Fasern erhalten wurden. Grundsätzlich war die Herstellung von Kern-Schale-Strukturen jedoch möglich.
Abb.91 Co-Elektrogesponnene Fasern aus Polystyrol als Hülle und Poly(ethylenoxid) als Kern
Modell Poly(vinylidendifluorid) / Poly(carbonat)
Auch aus dem System Poly(vinylindendifluorid) / Poly(carbonat) konnten Kern-Schale-Fasern erhalten werden. Hierbei wurde Poly(vinylidendifluorid) als Kernmaterial aus Dimethylformamid und Poly(carbonat) aus Dichlormethan versponnen. Abb. 92 zeigt die erhaltenen Strukturen in transmissionselektronenmikroskopischer Aufnahme. Zur
Verbesserung des Kontrastes erfolgte eine Anfärbung mit Rutheniumtetroxid. Es entstanden gleichmäßige Kern-Schale-Strukturen.
Abb. 92 Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Kern-Schale-Fasern mit Poly(vinylidendifluorid) als Kern und Poly(carbonat) als Schale
Modell Poly(carbonat) / Fluorescein
Zur Erweiterung der Zugänglichkeit neuer Strukturen wurde als Modellsystem eine wässrige Lösung von Fluorescein in Fasern aus Poly(carbonat) verkapselt. Hierzu wurde die
Poly(carbonat)lösung in Dichlormethan als Trägermaterial verwendet. Abb. 93 zeigt die damit erhaltenen Strukturen unter dem optischen und dem Fluoreszenzmikroskop. Deutlich ist zu erkennen, dass die Fluoresceinlösung in Form isolierte Tropfen in die Faser eingesponnen wurde. Anhand dieses Modellsystems konnte grundsätzlich gezeigt werden, das eine Einkapselung von wässrigen Lösungen in Polymerfasern möglich ist. Die erhaltenen Faserdurchmesser variierten bei diesem System zwar deutlich, es wurde allerdings auch Fasern mit einem Durchmesser von ungefähr einem Mikrometer beobachtet.
10 µm
10 µm
Abb. 93 Fasern aus Poly(carbonat) mit tropfenförmigen Einschlüssen einer wässrigen Fluoresceinlösung a) unter dem optischen b) unter dem Fluoreszenzmikroskop
Verkapselung von E.Coli in Poly(L-lactid)-Fasern
In Erweiterung der oben beschriebenen Verkapselung einer wässrigen Lösung mit Farbstoff wurde nun der Einbau von Bakterien in Kulturmedium in elektrogesponnene Fasern
untersucht. Hierzu fand Poly(L-lactid) aus Dichlormethan als Schalenmaterial Verwendung.
Als Kern wurde eine Lösung von E.coli in Medium verwendet. Die Anfärbung der Bakterien erfolgte nach dem Verspinnen auf Objektträger oder auf eine Wasseroberfläche mit einem LIVE / DEAD® BacLight™Viability Kit, das eine Anfärbung lebender Zellen ermöglicht.
Beobachtet werden konnte, das ein großer Teil der Bakterien nach dieser
Bestimmungsmethode den Spinnprozess selber unmittelbar überlebte. Es wurden Zellen in Lösung und teilweise auch entlang der Fasern beobachtet. Allerdings war dort auch teilweise wieder eine Ablösung durch Auswaschen zu erreichen. Diese Ergebnisse konnten eine Verkapselung nicht eindeutig zeigen. Es gab Hinweise darauf, dass vereinzelt Bakterien sich in den Fasern befanden. Hierzu sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig.
Abb. 94
Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Fasern aus Poly(L-lactid) versponnen mit E.coli in Medium
GFP als Modellprotein in Poly(carbonat)
Eine große Bedeutung kommt der Immobilisierung und Verkapselung von aktiven Biomolekülen zu. Anwendungen hierzu liegen unter anderem im Bereich der Sensorik.
Anhang eines relativ unempfindlichen Modellproteins wurde die Verkapselung einer Proteinlösung in elektrogesponnene Fasern mittels Co-Elektrospinnen untersucht. Hierfür wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) ausgewählt. GFP ist ein Enzym, das seit Jahrzehnten in der Forschung eingesetzt und ist sehr gut untersucht. Es findet zum Beispiel
aufgrund seiner Fluoreszenzeigenschaften Verwendung als Markersubstanz. Die intrinsische Fluoreszenz bleibt hier auch bei der Anbindung an die zu untersuchenden Strukturen erhalten und ermöglicht so eine einfache Detektion.
Abb. 95 zeigt die Struktur von GFP. Die β-Faltblätter formen einen Zylinder aus, in dessen Inneren die α-Helix und der Chromophor räumlich fixiert sind. Diese außergewöhnlich kompakte und stabile geometrische Struktur schirmt den Chromophor vollständig gegenüber äußeren Einflüssen, wie z.B. Sauerstoff oder Lösungsmittel ab und zeigt sich somit für die stabile und intensive intrinsische Fluoreszenz des GFP verantwortlich [158].
Abb. 95 Struktur von GFP [158]
Aufgrund der einfachen Detektierbarkeit und hohen Stabilität wurde GFP als Modellsubstanz ausgewählt.
Versponnen wurde Polycarbonat in Dichlormethan als Schalenmaterial mit GFP in wässriger Pufferlösung als Kern. Der Spinnprozess verlief nicht sehr gleichmäßig und es wurde daher Fasern sehr unterschiedlicher Durchmesser erhalten. Unter dem Fluoreszenzmikroskop konnte eine Einkapselung des GFP in die Fasern unter Erhalt von Fluoreszenzeigenschaften eindeutig beobachtet werden. Dies ist in Abb. 96 gezeigt. Damit war es möglich, anhand eines Modellsystems grundsätzlich die Immobilisierung eines Proteins in Co-Elektrogesponnene Fasern zu zeigen. Dies ist die Grundlage für weitere Anwendungen, z.B. der Verwendung aktiver Enzyme, von Wachstumsfaktoren oder optisch aktiver Systeme zur Sensorik.
Abb. 96 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von in Poly(carbonat)-Fasern eingekapseltem GFP
Experimenteller Teil
Verspinnen von Poly(ethylenoxid) mit der mobilen Anlage
Verwendet wurde Polyethylenoxid 900.000 von Fluka. Dies wurde in einer 4 % Lösung in Wasser eingesetzt und mit variablem Abstand und variabler Spannung versponnen. Eine typische Kombination bestand aus einer Spannung von 20 kV bei einem Abstand von ca. 15 cm. Die Durchflussrate wurde am Drehregler so eingestellt, dass keine Tropfen auftraten.
Verspinnen von Poly(ethylenoxid) mit der Anlage für landwirtschaftliche Anwendungen
Verwendet wurde Poly(ethylenoxid) 900.000 von Fluka. Dies wurde in einer 3% Lösung in Wasser eingesetzt. Die Spannung an der Kanüle betrug 16 kV bei einem Abstand von ca. 14 cm zum Boden. Die maximale Durchflussgeschwindigkeit lag bei 30-50 mL /h. Die Versuche zum Aufspinnen auf Gras wurden bei einer Außentemperatur von 14 °C durchgeführt.
Verspinnen von Poly(L-lactid)
Bei allen Spinnversuchen wurden Kunststoffspritzen von ein oder zwei Milliliter für die Lösungen verwendet. Als Spinndüse fanden Kanülen von 0,45 oder 0,6 mm
Außendurchmesser Verwendung, die vorher abgeschnitten und glatt geschliffen wurden.
Verwendet wurde Resomer L 210 von Boehringer. Dies wurde für die unterschiedlichen Versuche zur Matrixherstellung in Konzentrationen von 3,5-4 % versponnen. Die Parameter wurden jeweils so gewählt, dass ein gleichmäßiger Spinnvorgang stattfand. In Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit, die auch durch die Desinfektion der Anlage verändert wurde, und der Umgebungstemperatur wurden sowohl Abstand als auch Spannung der jeweiligen Situation angepasst. Typischerweise wurde ein Elektrodenabstand von ca. 15 cm bei einer Flussrate von 0,016 mL / min und einer Spannung von 10-15 kV gewählt. Die verwendete Spannung hing unter anderem auch von dem Material ab, auf das gesponnen wurde, z.B. Glasplättchen.
Sterilisation der Anlage
Verwendet wurde Peressigsäure in Form von Wofasteril E 400, Fa. Kesla. Eingesetzt wurde
sowie durch Versprühen eine Luftdesinfektion darin erhalten wurde. Nach einer Einwirkzeit von ca. 1 h in der geschlossenen Kammer wurde mit den Spinnvorgängen begonnen.
Herstellung der Faserproben für Zellkultur
Die Fasern wurden in der desinfizierten Anlage auf Glasplättchen gesponnen, die auf einer ebenfalls desinfizierten Glasplatte von ca. 20 x 20 cm lagen. Die Fasern wurden dann mit der jeweiligen Spinnlösung rundherum festgeklebt und zusätzlich durch mehrere Klebepunkte fixiert.
Herstellung der dreidimensionalen Faserproben
Die Fasern wurden auf ein vorher desinfiziertes durchlöchertes Aluminiumblech von ca. 10x 15 cm gesponnen. Nach mehreren Stunden wurde die entstandene Matte dann vorsichtig abgezogen und auf Glas-Objektträger geklebt.
Verspinnen der verschiedenen Polymere
Die typische Durchflussrate betrug 0,016 mL/min. Sie wurde zeitweilig während des Spinnprozesses variiert.
Poly(DL-lactid)
Verwendet wurde Resomer 208 von Boehringer aus einer 5% Lösung in Dichlormethan bei einem Elektrodenabstand von 15.20 cm und einer Spannung von ca. 25 kV.
Poly(DL-Lactid-co-glycolid) (Sigma)
Verwendet wurde eine 19% Lösung in Dichlormethan bei einem Elektrodenabstand ca. 25 cm und einer Spannung von ca. 45 kV.
Poly(3-hydroxybuttersäure-co-3-hydroxyvaleriansäure) (Aldrich)
Verwendet wurde eine 10% Lösung in Chloroform bei einem Elektrodenabstand von 15-20 cm, und einer Spannung von ca. 30 kV.
Poly-ε-caprolacton (Aldrich)
Verwendet wurde eine 15% Lösung aus Chloroform bei einem Elektrodenabstand von 15-20 cm und einer Spannung von ca. 40 kV.
Poly(DL-Lactid-co-caprolacton) Lactid / Caprolacton 86/14 (Aldrich)
Verwendet wurde eine 15% Lösung aus Chloroform bei einem Elektrodenabstand von 15-20 cm und einer Spannung von ca. 15 kV
Co-Verspinnen von Poly(styrol) / Poly(ethylenoxid)
Versponnen wurde als Kernmaterial eine Lösung von 3% Poly(ethylenoxid) in
Dichlormethan, als Schalenmaterial wurde eine 12% Lösung von Polystyrol in Dichlormethan verwendet. Der Abstand betrug ca. 15 cm, die Spannung wurde zwischen 10-15 kV variiert.
Die Durchflussrate betrug ca. 0.016 mL/min, wurde allerdings während des Spinnvorgangs so variiert, dass ein gleichmäßiges Spinnen erfolgte.
Co-Verspinnen von Poly(vinylidendifluorid) / Polycarbonat
Versponnen wurde als Kernmaterial eine 17% Lösung von Poly(vinylidendifluorid) in Dimethylformamid, als Schalenmaterial eine 15% von Polycarbonat in Dichlormethan. Die Spannung lag bei einem Abstand von 8 cm bei ca. 28,5 kV bei einer ungefähren
Durchflussrate von 0,016 mL/min.
Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung
Die Fasern wurden auf Kupfernetzchen 300 mesh aufgebracht und entweder direkt oder nach Kontrastierung im TEM JEOL JEM-3010 untersucht. Die Kontrastierung erfolgte über Rutheniumtetroxid, das durch Vermischen von Rutheniumchlorid und Natriumhypochlorit freigesetzt wurde. Die Kupfernetzchen wurden für wenige Sekunden in einem
Präparategläschen den sich aus einem Tropfen der Mischung entstehenden Dämpfen ausgesetzt.
Co-Verspinnen von E.coli
Außen wurde eine 3.5% Polylactidlösung in Dichlormethan verwendet. Bei Spannungen von 16.0 kV / 7.0 kV und einem Fluß mit 0.001 mL / 15 s ergaben sich Fasern.
Verwendet wurde E.coli HB 101 von Amersham in Standard I-Nährboullion von Merck.
Die Suspensionen von E.Coli wurden freundlicherweise durch Herrn Weng Tan bereitgestellt.
Von dem Nährmedium wurden 25 g/l in aqua. dest. gelöst und im Autoklav sterilisiert. Es wurde dann 1 mL HBN1 in 30 mL Medium gegeben und bei 180 rpm bei 37 °C 3 h rotiert.
Co-Verspinnen von Poly(carbonat) / Fluorescein
Als Kernmaterial wurde eine wässrige Lösung von 1,4 mg/mL Fluorescein verwendet. Als
Durchflussrate wurde variiert, die Spannung betrug bei einem Abstand von ca. 15 cm ca. 55 kV.
Co-Verspinnen von Poly(carbonat) / GFP
Als Schalenmaterial wurde eine 10% Lösung von Polycarbonat 64kD (Aldrich) in
Dichlormethan verwendet. Die Spinnbedingungen variierten, da jeweils nur kurzzeitig Fasern erhalten wurden. Die Durchflussrate betrug 0,04 mL / 15 s bei einem Elektrodenabstand von ca. 15 cm und einer Spannung von 17 -25 kV.
Das eingesetzte GFP wurde von Herrn Thomas Kurpiers (Arbeitskreis Dr. Henning Mootz, Universität Marburg) nach folgender Vorschrift dargestellt und mir freundlicher Weise zur Verfügung gestellt. Alle weiteren Biomoleküle und Chemikalien wurden gekauft und eingesetzt wie erhalten.
Das eGFP (enhanced GFP) wurde mit einer kurzen Peptidsequenz (Aminosäuren CFFKDEL + Restriktionsschnittstelle für KpnI) in den Vektor pET22b kloniert und besitzt somit einen C-terminalen His6-tag. Das fertige Plasmid pTK024 wurde dann mit dem E. coli Stamm BL21 transformiert. Für die Proteingewinnung wurde das Gen in E. coli (über-) exprimiert.
Dazu wurde 600 mL LB-Medium mit 6 mL (1:100) einer Übernachtkultur inokuliert und bis zu einer optischen Dichte von 0.7 bei 250 rpm und 37 °C wachsen gelassen. Danach wurde die Expression durch Zugabe von 0.4 mM IPTG induziert und die Zellen für 3-4 h bei 30°C Protein produzieren gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (7000 rpm, 20 min) abgetrennt, in Lysepuffer resuspendiert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), mit einer French Press, bzw. mit einem Emulsifier aufgeschlossen und die lösliche Fraktion durch erneute Zentrifugation von den unlöslichen Zellbestandteilen abgetrennt (30 min, 17000 rpm). Danach folgte die Reinigung durch IMAC, wegen des His6-tags also mithilfe der Ni-NTA-Chromatographie. Dazu wurde der Überstand der Zentrifugation 3x auf eine vorher equilibrierte 2 mL Ni-NTA-Säule gegeben. Anschließend wurde mit dem 10fachen
Säulenvolumen mit Auftragungspuffer gewaschen (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 5mM Imidazol, pH 8,0), dann mit dem 5 fachen Säulenvolumen Waschpuffer 1 (wie eben nur mit 20 mM Imidazol) dann mit 3 Säulenvolumen Waschpuffer 2 (" + 40 mM Imidazol). Das Protein wurde schließlich mit Elutionspuffer (" + 250 mM Imidazol eluiert. Der letzte Schritt war die Dialyse gegen einen Puffer der Wahl, z.B. PBS + 2-5 mM DTT + 10% Glycerin.
Damit konnte das Protein dann zum weiteren Gebrauch bei -80°C weggefroren werden.
Präparation von Knochenspongiosa
- Spongiosa in PBS zerkleinern und filtern
- Spongiosa-PBS–Filtrat in Falconröhrchen vorlegen
- 15 ml Ficoll-Paque in weiterem 50 ml Falconröhrchen vorlegen und mit Blut-PBS-Gemisch vorsichtig überschichten
- Abzentrifugieren: 800 g, 19°C, 25 min,
- Mono-Nucleare Zellen mit einer einmal Kunststoffpipette abnehmen und in ein 50 ml Falconröhrchen geben
- Mit PBS auf 50 ml auffüllen
- Abzentrifugieren: 300 g, 19°C, 5 min
- Überstand verwerfen
- Zellpellet in 10 ml PBS resuspendieren und erneut mit PBS auf 50 ml auffüllen
- Abzentrifugieren: 300 g, 19°C, 5 min
- Überstand verwerfen
- Mit 12 ml Medium resuspendieren und in eine mittlere Kulturflasche überführen
- Bei 37°C im Brutschrank (5% CO²) in Kultur halten
Unter einer Sterilbank wird die zuvor entnommene Spongiosa in PBS zerkleinert und in ein 50 ml Falconröhrchen gefiltert.
In einem weiteren Falconröhrchen werden 15 ml Ficoll-Paque vorgelegt. Dieses wird dann mit dem abgefilterten Spongiosa-PBS-Gemisch vorsichtig überschichtet und anschließend zentrifugiert (800g, 19°C, 25 min).
Aus der sich resultierenden Schichtung werden die mononuclearen Zellen mit einer
Kunststoffpipette abgenommen, in ein leeres Falconröhrchen übertragen, mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und abzentrifugiert (300g, 19°C, 5 min).
Im Anschluss daran wird der Überstand verworfen, das Pellet in 10 ml PBS resuspendiert und mit PBS auf 50 ml aufgefüllt.
Nach einem letzten Zentrifugations-Vorgang (300g, 19°C, 5 min) wird erneut der Überstand verworfen, das Pellet jedoch wird nun mit 12 ml Kulturmedium (Zusammensetzung s.o.) resuspendiert und einer mittlere Kulturflasche zugefügt.
Im Brutschrank bei 37°C, können die mesenchymalen Stammzellen sodann über Nacht adhärieren.
Am nächsten Tag wird der non-adhärente Zellüberstand durch mehrmaliges Spülen mit PBS
Es schließt sich ein regelmäßiger Mediumwechsel alle 2-3 Tage an, bis die Zellen konfluent sind.
Passagieren / Trypsinisieren
Kulturmedium in Falconröhrchen vorlegen Mit 10 ml PBS Kulturflasche spülen
5 min Inkubation der Zellen mit 2 ml Trypsin im Brutschrank durch Klopfen der Flasche Zellen vom Boden lösen
Kulturflasche mit vorgelegten Medium durchspülen Mit PBS nachspülen
Zellen abzentrifugieren Überstand verwerfen
Pellet mit PBS resuspendieren und auf 50 ml auffüllen Abzentrifugieren und Überstand verwerfen
Mit Medium die MSC resuspendieren und in Kulturflaschen überführen Bei 37°C im Brutschrank (5%CO²) in Kultur halten
Ist der Flaschenboden konfluent (zu 70% bewachsen) besteht die Möglichkeit die Zellen mit Hilfe von Trypsin abzulösen, um diese weiter in Kultur zu halten, bzw. ein Vermehren der Zellkultur zu ermöglichen.
Dazu wird das Kulturmedium der MSC in ein Falconröhrchen vorgelegt. Mit 10 ml PBS wird dann die Kulturflasche gespült und der Boden anschließend mit 2 ml Trypsin bedeckt. Zum Ablösen der Zellen inkubiert man die Flasche ca. 5 min in dem Brutschrank. Durch beklopfen der Flasche lösen sich die Zellen meist sehr gut, so dass man diese dann mit dem vorgelegten Kulturmedium ( 10 ml ) herausspülen kann. Zusätzlich spült man 1-2 x mit PBS nach und zentrifugiert die Zellen ab (300 g, 19°C, 5 min). Das Pellet wird mit PBS resuspendiert, auf 50 ml aufgefüllt und nochmals abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die Zellen in Medium aufgenommen und erneut in Kulturflaschen überführt.
Ansatz von Medium (Standardmedium MSC):
500 ml DMEM low Glucose 10% FCS
1% Penicillin / Streptomycin
Zusammensetzung Differenzierungsmedium:
Osteogenesis Induction Medium (OIM)
500 ml DMEM low Glucose 10% FCS
5 ml Penicillin / Streptomycin
10 mM ß-Glycerolphosphat - 1,08 g sterilfiltrieren Jeweils frisch hinzugeben:
0,05 mM Ascorbin-Acid-2-Phosphate (0,25 M stock) (10µl pro 50 ml Medium) 0,1 µM Dexamethason (1 mM stock in 100% Ethanol)
Dexamethason:
2 mg Dexamethason +5 ml Ethanol absolut = 1mM 5 µl stock + 1ml Medium
70µl für 37 ml Medium ( 95µl für 50 ml Medium)
Rasterelektronenmikroskopie (REM) Primärfixierung
Zunächst wird das Medium abgesaugt und die Probe dreimal mit PBS gewaschen.
Anschließend wird die Probe für zwei Stunden mit der Fixierlösung fixiert.
Fixierlösung: Cacodylatpuffer pH 7,4
Aqua dest. wird im Verhältnis 4,6:4,6:0,8 gemischt Glutardialdehydlösung 25%
Danach wird die Fixierlösung abgesaugt und dreimal mit dem Cacodylatpuffer gespült.
Anschließend kann die Probe bis zur Sekundärfixierung im Cacodylatpuffer bei 4°C im Kühlschrank gelagert werden.
Sekundärfixierung
Die Sekundärfixierung mit Osmiumsäure muss zwingend unter einem Abzug erfolgen, da Osmiumsäure stark toxisch und leicht flüchtig ist! Der Cacodylatpuffer wird abgesaugt. Dann wird die Probe in 1%iger Osmiumsäure für 1 Stunde fixiert. Danach wird die Osmiumsäure wieder abgenommen und die Proben werden 3-mal mit Aqua dest. gewaschen. Danach folgt eine Entwässerung der Probe in einer aufsteigenden Ethanolreihe (30% / 50% / 70% / 80% / 90% / 100% / 100%) für je 5-15 Min. an die sich die Trocknung in der Critical-Point-Kammer anschließt. Hierbei wird durch Verwendung von überkritischem Kohlendioxid das Wasser vollständig entfernt.
Die Proben werden dann auf die Träger für die Elektronenmikroskopie aufgebracht und zunächst mit Graphit, dann mit Gold bedampft.
Die Untersuchung erfolgte an einem Hitachi S-4100 Rasterelektronenmikroskop.
Materialien
- Glutaraldehyd 25% Serva - Cacodylatpuffer Serva - Osmiumtetroxid Roche Fixierungen
Formalinfixierung
Das Medium wird abgesaut und die Proben werden 3-mal mit PBS gewaschen.
Danach wird eine 4% Formalinlösung für eine Stunde auf die Proben gegeben.
Lagerung in einem geschlossenen Behälter im Kühlschrank bei +4 C möglich.
Methanol / Aceton Fixierung:
Methanol und Aceton werden bei -20 C im Eisschrank vorgekühlt.
Das Medium wird abgesaugt und die Proben werden 3-mal mit PBS gewaschen.
Danach werden die sie für jeweils 5-10 Min. bei -20 C erst in Methanol und dann in Aceton getaucht und für einen Tag bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Proben werden im Anschluss trocken bei -20 C gelagert.
OPG-ELISA
− Es werden 100µl Assaypuffer pro Vertiefung in die Mikrotiterplatte pipettiert
− Die Vertiefungen A1,2 bis E1,2 werden jeweils mit 50µl Standard gefüllt
− Die Vertiefungen F1,2 bis H1,2 werden mit Nährmedium (pur) je 50µl befüllt
− Je nach notwendiger Probenverdünnung werden 200µl des zu messenden Mediums pro Well pipettiert. Es wird eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Pipettiert wird jeweils von oben nach unten
− Anschließend werden 50µl des 2. Antikörpers je Vertiefung hinzugegeben. Zur Vermischung sollte die Platte vorsichtig gerüttelt werden und mit einer Folie abgedeckt werden.
− Die Platte wird nun für 18-24Stunden bei 4°C im Kühlschrank gelagert.
− Am nächsten Tag wird die Lösung verworfen und die Vertiefungen 5-mal mit je 300µl Waschpuffer gespült. Der erste Spülvorgang sollte mit der Pipette durchgeführt werden. Danach kann eventuell mit einer Spülflasche weiter gespült werden.
Zwischendurch wird die Platte umgekehrt auf Löschpapier vorsichtig abgetrocknet.
− Nach dem letzten Waschvorgang wird die Platte über Löschpapier heftig ausgeschlagen.
− Dann Pipettierung von 200µl Konjugat pro Vertiefung und Inkubation unter Folie bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
− Der Inhalt wird jetzt wieder verworfen und wiederum 5-mal mit je 300µl Waschpuffer gespült (s.o.).
− Nun wird je 200µl TMB-Substratpuffer pro Vertiefung pipettiert.
− Nach 15-20Min. werden jetzt 50µl Stopplösung zugesetzt und die Platte gerüttelt.
− Cave- werden Proben der gleichen Charge auf mehrere Kits verteilt, so ist unbedingt die Reihenfolge der Pipettierschritte und die Zeit bis zum Zusetzen der Stopplösung genau einzuhalten.
− Die Extinktion wird im Mikrotiterplattenphotometer bei 450nm gegen die Referenzwellenlänge von 620nm gemessen
− Der Bezug der gemessenen Konzentration zur Zellzahl pro Well wird über eine Bestimmung des Gesamtproteins des Mediums vorgenommen.
Material und Reagenzien
- Osteoprotegerin-ELISA-Kit,(KB 1011) ImmunDiagnostik
-Immunfluoreszenzfärbung
− Die zu untersuchenden Proben werden nach dem Absaugen des Mediums dreimal sorgfältig mit 0,1M PBS, pH 7,4 gewaschen.
− Dann Fixierung des Probenmaterials zunächst 5 Min. in Methanol, anschließend 1-2 Min. in Aceton (Lagerung beider Lösungen bei -20 Grad Celsius).
− Trocknenlassen und bis zur Weiterverarbeitung bei -20 Grad Celsius konservieren.
− Plättchen bei RT auftauen lassen, in PBS anfeuchten und in feuchter Kammer anordnen.
− Dabei berücksichtigen, dass die gewählte Reihenfolge unverändert durch alle Schritte hindurch beibehalten wird! Darauf achten, dass Ober- und Unterseite nicht vertauscht werden!
− Primär-AK in optimaler Verdünnung mit PBS bereitstellen, dabei beachten, dass pro Plättchen 50µl (bei größeren Plättchen auch 100µl) in Lösung benötigt werden.
Nichtverwertetes Material ist am Ende zu entsorgen, da es nicht haltbar ist.
− Primär-AK mit Pipette auf Plättchen geben, 45 Min. bei Raumtemperatur in feuchter Kammer inkubieren lassen.
− Dreimal 10-20 Min. in PBS spülen.
− Die folgenden Schritte sollten, wenn möglich, im abgedunkelten Raum erfolgen.
Optimal ist eine IR-Beleuchtung!
− Bereitstellung des Sekundär-AK (dabei die Herkunft des Primär-AK berücksichtigen!). Die Konzentration des AK wird je nach Empfehlung des Herstellers gewählt. Hier 1:3000
− 30 Min. im Dunkeln inkubieren lassen.
− DAPI, 1:1000 für jeweils 30 sec. hinzugeben (ca. 50µl )
− Erneut dreimal 10-20 Min. in PBS spülen.
− Plättchen trocknen lassen und in Fluoromount eindecken.
− Bis zur Auswertung der Färbung am Fluoreszenzmikroskop können die Proben einige Tage bei 4°C im Dunkeln gelagert werden.
Materialien und Reagenzien Primäre Antikörper
- Anti-Collagen-I, Mouse monoclonal, (ab6308) Abcam - Anti-Osteopontin, Rabbit polyclonal, (Ab8448) Abcam - Anti-Bone Alk. Phosphatase, Mouse monoclonal, (ab17272) Abcam - Anti-Bone Alk. Phosphatase, Mouse monoclonal, (BM213) Acris - Anti-Osteocalcin, Rabbit polyclonal,(BP710) Acris