4 ERGEBNISSE
4.2 Untersuchungen zur Struktur acylierter Leguminproben
4.2.4 Spektroskopische Untersuchungen
4.2.4.3 Circulardichroitische Spektrometrie acylierter Leguminproben
-0,05 0 0,05
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2 A/d2
I=0,1 I=0,5 I=1,0
-0,08 0 0,08
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2 A/d2
I=0,1 I=0,5 I=1,0
Abbildung 60: Differenzableitungsspektren von 64% (links) und 99% (rechts) succinyliertem Legumin in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Tabelle 13: Streckenverhältnis a/b berechnet aus den UV-Ableitungsspektren 2. Ordnung nach RAGONE et al. [146]
nativ 58% ac 98% ac 64% suc 94% suc 99% suc
I=0,1 1,44 1,65 1,47 2,06 2,12 2,24
I=0,5 1,52 1,57 1,43 1,79 2,12 2,17
I=1,0 1,55 1,63 1,41 1,77 2,06 2,22
-8.000 0 8.000
190 200 210 220 230 240 250 260 Wellenlänge [nm]
[deg*cm2 /dmol]
nativ 58%
98%
-110 0 110
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
nativ 58%
98%
Abbildung 61: CD-Spektren von nativem und acetyliertem Legumin im fernen UV und Standardpuffer
Abbildung 62: CD-Spektren von nativem und acetyliertem Legumin im nahen UV und Standardpuffer
Das CD-Spektrum des nativen Legumins im nahen UV weist ein Maximum bei 284 nm und ein Maximum bei 291 nm entsprechend den Tyrosin- und Tryptophan-Chromophoren auf. Die Acetylierung führt nicht zur Verschiebung der Maxima zwischen 280 und 300 nm. Im nahen UV nimmt die molare Elliptizität, besonders im Bereich des Tryp-tophans (Wellenlängenbereich 288-295 nm [147]) durch Acetylierung stufenweise ab.
Das CD-Spektrum der vollständig acetylierten Probe zeigt außerdem Veränderungen im Bereich des Tyrosins (270-280 nm [147]) und eine Zunahme der Elliptizitäten bei Wellen-längen unter 270 nm.
Abbildung 63 und Abbildung 64 stellen die CD-Spektren succinylierter Legumine sowie die des nativen Legumins im fernen und nahen UV-Bereich dar.
-8.000 0 8.000
190 200 210 220 230 240 250 260 Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
nativ 64%
95%
-110 0 110
250 260 270 280 290 300 Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
nativ 64%
95%
Abbildung 63: CD-Spektren von nativem und succinyliertem Legumin im fernen UV und Standardpuffer
Abbildung 64: CD-Spektren von nativem und succinyliertem Legumin im nahen UV und Standardpuffer
Mit zunehmender Succinylierung verändert sich das CD-Spektrum im fernen UV. Die Än-derung der Sekundärstruktur zeigt sich besonders bei den für helikale Strukturanteile typischen zwei Minima. Die Blauverschiebung der 216/209 nm-Doppelbande bis zu einer Wellenlänge von 205 nm (hochsuccinylierte Probe) weist auf Denaturationseffekte infolge Succinylierung hin. Auch das Maximum verschiebt sich aufgrund der Succinylierung von 64 % der Aminogruppen um 3 nm hypsochrom; das CD-Spektrum der vollständig succi-nylierten Probe bleibt bis ≤ 190 nm ohne Maximum. Differenzierte Aussagen zur Berech-nung der Sekundärstrukturanteile aus den Fern-UV-CD-Spektren sind Tabelle 14 und Abbildung 69 zu entnehmen.
Die CD-Spektren im nahen UV (Abbildung 64) zeigen nach Einführung von Succi-nylgruppen deutliche Veränderungen sowohl im Bereich der Tryptophan- als auch der Tyrosin-Absorptionsbanden (291 nm und 284 nm). Der Verlauf der CD-Spektren von 64 % und 95 % succinylierten Leguminproben ähnelt sich, aber die Elliptizität nimmt mit zunehmender Succinylierung des Proteins ab.
Ionenstärkeabhängigkeit des CD von nativem und succinyliertem Legumin
Unmodifiziertes, sowie teilweise succinyliertes und hochsuccinyliertes Legumin wurden in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke untersucht. In Abbildung 65 und Abbildung 66 sind die CD-Spektren succinylierter Proben im fernen UV-Bereich, in Abbildung 67 und Abbildung 68 die CD-Spektren im nahen UV dargestellt. Der Puffer hoher Ionenstärke (I=1,0) ist für die Aufnahme von CD-Spektren im fernen UV relativ ungeeignet, weil die hohe Ionendichte die Aufnahme des Spektrums unterhalb 195 nm (hochmodifizierte Probe) bzw. 192 nm verhindert.
-14.000 -7.000 0 7.000
190 200 210 220 230 240 250 260 Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
I=0,1 I=0,5 I=1,0
-14.000 -7.000 0 7.000
190 200 210 220 230 240 250 260 Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
I=0,1 I=0,5 I=1,0
Abbildung 65: Fern-UV-CD-Spektren von 64 % succinyliertem Legumin in Puffern unterschiedlicher Ionenstärke
Abbildung 66: Fern-UV-CD-Spektren von 99 % succinyliertem Legumin in Puffern unterschiedlicher Ionenstärke
Die CD-Spektren von nativem Legumin in den Phosphatpuffern unterschiedlicher Io-nenstärke verlaufen im fernen UV-Bereich quasi identisch und sind daher nicht abgebildet (zum Vergleich siehe natives Legumin in Standardpuffer in Abbildung 63).
Abbildung 65 zeigt deutlich, daß die gemessenen Elliptizitäten (Maximum und Mini-mum) 64 % succinylierter Ackerbohnen-Legumine im fernen UV mit steigender Salzio-nenkonzentration zunehmen. Das Minimum verschiebt sich in niedriger Ionenstärke um 3 nm zu einer Wellenlänge von 204 nm (Blauverschiebung). Auch bei 99 % Succinylie-rung hängt die Sekundärstruktur stark von der Ionenstärke des Lösungsmittels ab (Abbildung 66). Zu besonders deutlichen Veränderungen der Sekundärstruktur dieser Probe kommt es in Puffer niedriger Ionenstärke. Mit dem Minimum der Elliptizität bei ei-ner Wellenlänge von nur 199 nm entspricht das CD-Spektrum der für ungeordnete Kon-formation bekannten Kurvenform.
Zur Ionenstärkeabhängigkeit der berechneten Sekundärstrukturanteile siehe Tabelle 15.
Im nahen UV weisen die CD-Spektren der nativen und der teilweise succinylierten Probe in den Puffern mit I=0,1 und I=0,5 zwei Maxima auf: bei 291 nm (Trp) und 284 nm (Tyr, Trp). Der Nah-UV-CD des nativen Legumins ist in den drei untersuchten Phosphatpuffer-systemen quasi identisch und daher nicht abgebildet (zum Vergleich siehe natives Legu-min in Standardpuffer in Abbildung 64).
-50 0 50 100
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
I=0,1 I=0,5 I=1,0
-50 0 50 100
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2 /dmol]
I=0,1 I=0,5 I=1,0
Abbildung 67: Nah-UV-CD-Spektren von 64 % succinyliertem Legumin in Puffern unterschiedlicher Ionenstärke
Abbildung 68: Nah-UV-CD-Spektren von 99 % succinyliertem Legumin in Puffern unterschiedlicher Ionenstärke
Die Nah-UV-CD-Spektren von 64 % N-succinyliertem Legumin (Abbildung 67) ändern sich in Abhängigkeit von der Ionenstärke des Lösungsmittels. Die Elliptizität nimmt mit höherer Ionenstärke zu. Bei einer Wellenlänge von 284 nm steigt der Wert der molaren
Elliptizität von 55 deg•cm2•dmol-1 bei niedriger Ionenstärke auf Θ = 80 deg•cm2•dmol-1 in Phosphatpuffer der Ionenstärke 1,0.
Die CD-Spektren der hochsuccinylierten Probe (Abbildung 68), bei denen unabhängig von der Ionenstärke ohnehin nur sehr geringe Elliptizitäten gemessen werden, verhalten sich ähnlich. Der geringe Circulardichroismus der aromatischen Reste weist auf das Feh-len von größeren AnteiFeh-len an geordneten Strukturen hin [119]. Die Spektren spiegeln dennoch den stabilisierenden Effekt hoher Ionenstärke auf die übrige Tertiärstruktur wi-der. Die molare Elliptizität bei 284 nm Wellenlänge steigt von 8 deg•cm2•dmol (I=0,1) auf Θ = 25 deg•cm2•dmol-1 (I=1,0).
Berechnungen von Sekundärstrukturanteilen
CD-Banden im nahen UV-Bereich (250–320 nm) entstehen durch die Absorption an den aromatischen Seitenketten. Sie wird beobachtet, wenn in den Chromophoren durch deren unmittelbare Umgebung eine elektronische Chiralität induziert wird, z. B. durch die Fal-tung und EntfalFal-tung eines Proteins. Auf diese Weise enthält der Circulardichroismus In-formationen über die Tertiärstruktur.
Es gibt eine große Anzahl an statistischen Auswerteprogrammen, um die Sekundärstruk-turanteile eines Proteins anhand seines CD-Spektrums im fernen UV vorauszusagen, da diese Spektren im Spektralbereich der Amidchromophore (170–250 nm) hauptsächlich von der Sekundärstruktur der Polypeptidketten im Protein (Peptidbindungen) bestimmt werden. Sie beruhen auf der Annahme, daß ein Protein-CD-Spektrum in diesem Bereich als lineare Kombination der Beiträge der unterschiedlichen Sekundärstrukturen (Helix, β -Faltblatt, turn- und nichtreguläre, auch als “Rest” bezeichnete Strukturen) dargestellt werden kann. Die verschiedenen Methoden zur Berechnung der Sekundärstrukturanteile unterscheiden sich vor allem durch die Anzahl und Auswahl der Basisspektren, sowie im mathematischen Formalismus und der Auswahl der Selektionskriterien. Für die von mir aufgenommenen Spektren bot sich die Methode nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34]
(Computerprogramm CONTIN) an, die bereits in früheren Arbeiten an ähnlichen Protei-nen [33, 131] herangezogen worden ist. Zugrunde liegen die CD-Spektren von 17 struk-turell aufgeklärten Proteinen als Referenzspektren. Bevorzugt wurde von mir die nach JOHNSON [148] modifizierte CONTIN-Methode der Auswertung, die, abgesehen von der Übereinstimmung mit den typischen Referenzspektren, die Lösung mit den geringsten Freiheitsgraden auswählt. Für die Berechnung von Sekundärstrukturanteilen nach dieser Methode müssen die CD-Spektren, analog den Referenzspektren, im Bereich von 190-240 nm aufgenommen werden. Da das jedoch im Phosphatpuffer der Ionenstärke I=1,0 nicht möglich war, sind die für dieses Puffersystem dennoch angegebenen berech-neten Strukturanteile mit großer Unsicherheit behaftet. Es wird darauf hingewiesen, daß
die Berechnung der Sekundärstrukturanteile generell eher den Charakter einer Abschät-zung hat. Abbildung 69 zeigt die Änderung der berechneten Sekundärstrukturanteile mit zunehmender Acetylierung und Succinylierung. Die entsprechenden Werte sind Tabelle 14 zu entnehmen.
b-Faltblatt b-turn a-Helix Rest
nativ 5 8 %
9 8 % 0
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5
Strukturanteile [%]
ACETYLIERUNG
b-Faltblatt b-turn a-Helix Rest
nativ 6 4 %
9 5 % 0
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5
Strukturanteile [%]
SUCCINYLIERUNG
Abbildung 69: Änderung der Sekundärstrukturanteile durch Acylierung von Legumin in Standardpuf-fer, berechnet nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifiziert nach JOHNSON [148]
Tabelle 14: Sekundärstrukturanteile acylierter Ackerbohnen-Legumine in Standardpuffer, berech-net nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifiziert nach JOHNSON [148].
Der Fehler der Methode beträgt ± 1%.
β-Faltblatt [%] β-turn [%] α-Helix [%] Rest [%]
nativ 44 19 17 20
58% Acetylierung 43 21 12 24
98% Acetylierung 44 20 10 26
64% Succinylierung 43 20 13 24
95% Succinylierung 43 21 9 27
Sowohl bei der Acetylierung als auch durch die Succinylierung nimmt der Anteil an α -helikalen Strukturen ab, während der Anteil an β-Strukturen fast konstant bleibt. Dem-entsprechend erhöht sich der Anteil ungeordneter Strukturen.
Der Einfluß der Ionenstärke des Lösungsmittels auf die Sekundärstruktur von nativem und succinyliertem Legumin wurde anhand der CD-Spektren im fernen UV untersucht und ebenfalls mit dem Auswerteverfahren nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34],
modifi-ziert nach JOHNSON [148], quantifimodifi-ziert. Die Ergebnisse sind Tabelle 15 zu entnehmen.
Die für Puffer der Ionenstärke I=1,0 berechneten, in Klammern angegebenen, Werte sind wegen der bereits beschriebenen Gründe nicht abgesichert.
Tabelle 15: Sekundärstrukturanteile von nativem Legumin und succinylierten Leguminderivaten in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke, berechnet nach der Methode von PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifiziert nach JOHNSON [148] (Fehler ± 1 %)
β-Faltblatt [%] β-turn [%] α-Helix [%] Rest [%]
nativ I=0,1 49 25 14 13
I=0,5 44 19 17 20
I=1,0 (45) (19) (14) (22)
64% suc I=0,1 46 21 8 26
I=0,5 43 20 13 24
I=1,0 (40) (20) (17) (23)
99% suc I=0,1 44 22 5 30
I=0,5 43 21 9 27
I=1,0 (42) (23) (7) (29)
Für natives Legumin wurden höhere Anteile an β-Faltblatt und β-turns in Puffer niedriger Ionenstärke berechnet. Der berechnete Anteil an α-Helix ist mit 17 % im Standardpuffer (I=0,5) etwas höher als in niedriger Ionenstärke (I=0,1).
Auch bei der 64 % succinylierten Probe wird durch die Erhöhung der Ionenstärke der An-teil an β-Faltblatt-Strukturen herabgesetzt. Unter Einbeziehung des möglichen Fehlers ist der Unterschied jedoch nicht signifikant. In der Hauptsache ist die Abnahme α-helikaler Strukturen entsprechend einer geringeren Stabilisierung bei niedriger Ionenstärke zu verzeichnen.
Die Sekundärstruktur der erschöpfend succinylierten Probe ist den Fern-UV-CD-Spektren zufolge von der Ionenstärke wenig abhängig. Die errechneten β-Strukturanteile ändern sich lediglich im Fehlerbereich der Methode. In allen drei Puffersystemen wurden mit ei-nem Anteil von weniger als 10 % nur sehr geringe α-Strukturbereiche (am geringsten bei I=0,1), zugunsten erhöhter nichtregulärer Strukturanteile, berechnet.