4 Ergebnisse
4.1 Etablierung von BAC-Klonen für die Chromosomen 13, 21 und 22 Zum Nachweis von strukturellen und numerischen Chromosomenveränderungen mittels
4.1.3 Chromosom 22 spezifische BACs
Die FISH an invasiv gewonnenen kindlichen Zellen z.B. aus Amniozentesen oder Chorionbiopsien sollte, mit den von mir entwickelten FISH-Proben, möglich sein.
Beispielhaft wurden kultivierte Amnionzellen mit dem Karyotyp 47,XY,+21 verwendet. Der BAC 10293M ist spezifisch für das Chromosom 21 und wies drei Signale in den Interphasekernen auf, hingegen wurde für die Y-spezifische alpha-Satelliten FISH-Sonde nur ein Signal detektiert. Es gelang mit der Sondenkombination aus BAC 10293M (Chromosom 21) und dem Plasmid pLAY5.5 (Y-Chromosom) die Trisomie 21 und das männliche Geschlecht nachzuweisen (Abbildung 4-5 C).
(clathrin, heavy polypeptide-like 1) und HIRA (histone cell cycle regulation defective, S.
cerevisiae, homolog of A) (Abbildung 4-6).
16,2 Mb 18,2 Mb 18,2 Mb 18,3 Mb
LCR A LCR B
RH1 1351
16,1 Mb 11416E
17441E
CLTCL1 HIRA
Zen. Tel.
LCR A-B 11416E, 17441E LCR B-C 12446F, 12336I 02416N, 22489F 22
22q11
22q13
18,2 Mb1 18,3 Mb
LCR B ZNF74 LCR C LCR D
17,4 Mb
RH1 04435
17,6 Mb 12336I RH4
8934
17,5 Mb 12464F
18,1 Mb
Zen. Tel.
stbK29 9D3
A
45,4 Mb 02416N
RH1 1296
47,3 Mb 22489F
Zen. Tel.
Abbildung 4-6 Übersicht der BACs vom Chromosom 22
In der linken oberen Ecke wird die zytogenetische Lokalisation der sechs BAC-Klone des
Chromosoms 22 dargestellt. In der vergrößerten Darstellung ist die Anordnung vom Zentromer zum Telomer hin, von links nach rechts. Marker und Gene (grau) werden mit der ungefähren Position (Mb) innerhalb der physikalischen Karte angegeben. Die Anwesenheit von repetitiven Sequenzen der low-copy-repeats (LCR) A bis D sind grün gekennzeichnet. Die BACs zwischen den LCR A und B überlagern sich und decken die Gene CLTCL1 und HIRA ab. Die BACs 12464F und 12336I befinden sich zwischen den LCRs B und C. Je ein BAC-Ende von 12464F bzw. 12336I decken Sequenzen in dem LCR B bzw. LCR C ab. Die Sequenzidentitäten der BAC-Enden zu verschiedenen LCRs sind mit farbigen Sternen gekennzeichnet.
CLTCL1 (Clathrin, heavy polypeptide-like 1); HIRA (Histone cell cycle regulation defective, S.
cerevisiae, homolog of, A); ZNF74 (Zinc finger protein 74)
Im Bereich zwischen den Repeats B und C sind die BACs 12464F und 12336I lokalisiert (Tabelle 4-5). Beide BACs decken zusammen einen Bereich von 338 kb ab. Die Sequenzierung der BAC-Enden ergab, dass BAC 12464F mit Teilen des LCR B identisch ist und auch identisch mit Bereichen der LCRs A und D. Das telomerwärts gerichtete Ende des
BAC 12336I war zu 97% identisch mit einem Element aus dem LCR C und auch zu 97% mit einem Sequenzbereich des PAC Klon p_n5 proximal zu LCR D (Tabelle 4-6, Abbildung 4-6).
Als Hybridisierungskontrollen wurden in der Nähe des Telomers die BACs 02416N (TelA) und 22489F (22-42) etabliert. Die BAC-Endsequenzierungen bestätigten eine Distanz von ca.
2,5 Mb des BAC 02416N zum Telomer und BAC 22489F war nur ca. 50 kb vom Telomer entfernt (Tabelle 4-6). In der Abbildung 4-6 sind sämtliche BAC-Klone des Chromosom 22 schematisch dargestellt.
Tabelle 4-6 Ergebnisse der Sequenzanalysen der BAC-Endsequenzen für BAC-Klone, die zu Chromosom 22 kartieren
Ergebnisse der Vergleiche der BAC-Endsequenzen mit den genomischen Contigs nach der Analyse durch 'nr-Blast'. Für jedes der sequenzierten BAC-Enden, das mit einem genomischen Klon identisch ist, ist neben der Datenbankadresse die Bezeichnung des Klons angegeben. Das zentromernahe BAC-Ende ist mit 'zen' und das telomernahe BAC-BAC-Ende mit 'tel' bezeichnet und Buchstaben A bis D bezeichnen die LCRs innerhalb der TDR. In der letzten Spalte ist angeführt, wieviele Basenpaare der BAC-Sequenz mit dem genomischen Klon identisch sind.
Homologie zu genomischem Klon BAC Datenbank
Adresse genomischer Klon Identität
zen gi|7122563|gb|
AC000072
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 Cosmid Clone 15a10 In DGCR Region
483/483 (100%) 11416E
tel gi|7124533|gb|
AC000081
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 Cosmid Clone 59c10 In DGCR Region
636/636 (100%) zen gi|7122563|gb|
AC000072
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 Cosmid Clone 15a10 In DGCR Region
447/462 (96%), 17441E
tel gi|7124755|gb|
AC000087
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 Cosmid Clone 83c5 In DGCR Region
562/568 (98%) zen
A
gi|22450601|gb|
AC008079
Homo sapiens chromosome 22q11 clone bac519d21 385/388 (99%) zen
A
gi|11142035|gb|
AC008132
Homo sapiens chromosome 22q11 clone pac995o6 387/388 (99%) zen
A
gi|24137491|gb|
AC008103
Homo sapiens chromosome 22q12 clone pac699j1 383/388 (98%) zen
B
gi|7712132|gb|
AC024070
Homo sapiens chromosome 22q11 clone chk89 386/388 (99%) zen
B
gi|9625348|gb|
AC074203
Homo sapiens chromosome 22q11 clone cos4 388/388 (100%) zen
D
gi|5931536|dbj|
AP000550
Homo sapiens genomic DNA, chromosome 22q11.2,BCRL2 region,clone:KB1592A4
387/388 (99%) zen
D
gi|7958973|gb|
AC008018
Homo sapiens chromosome 22q11 clone b379n11 387/388 (99%) 12464F
tel gi|4581183|gb|
AC004033
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 PAC Clone p_m11 In BCRL2-GGT Region,
438/440 (99%) zen gi|4581183|gb|
AC004033
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 PAC Clone p_m11 In BCRL2-GGT Region
484/484 (100%) tel
C
gi|6456174|gb|
AC007050
Homo sapiens chromosome 22q11 clone bac32 310/319 (97%) 12336I
rev gi|7958980|gb|
AC002472
Homo sapiens Chromosome 22q11.2 PAC Clone p_n5 In BCRL2-GGT Region
310/319 (97%)
Homologie zu genomischem Klon BAC Datenbank
Adresse genomischer Klon Identität
zen gi|2956679|emb
|AL008720
Human DNA sequence from clone CTA-343C1 on chromosome 22 Contains a putative novel gene, ESTs, STSs and GSSs
277/277 (100%) 02416N
tel gi|6002334|emb
|AL096853
Human DNA sequence from clone CITF22-96H12 on chromosome 22 Contains the first coding exon of a novel gene, STSs and a putative CpG island
456/458 (99%) zen gi|5804920|emb
|AL096767
Human DNA sequence from clone 579N16 on chromosome 22. Contains the 3' part of the gene for KIAA0685, the SBF1 gene for SET binding factor 1
305/305 (100%) 22489F tel gi|5804920|emb
|AL096767
Human DNA sequence from clone 579N16 on chromosome 22. Contains the 3' part of the gene for KIAA0685, the SBF1 gene for SET binding factor 1
458/469 (97%)
4.1.3.1 Anwendungsbeispiel Chromosom 22 BACs
Ziel war es die Robustheit der Chromosom 22 spezifischen Sondenkombination (BAC 11416E und 17441E) für den Routineeinsatz so weit wie möglich zu optimieren. Die FISH-Sonden sollten spezifische und distinkte Signale in Interphasekernen zeigen. Diese Qualitätsmerkmale sollten auch vorhanden sein, wenn die Objektträger nicht vorbehandelt werden und nur ein Waschschritt nach der Hybridisierung erfolgt.
A
B
C
Abbildung 4-7 Hybridisierung der Chromosom 22 spezifischen BACs 11416E und 17441E A) Die Hybridisierung der Sondenkombination von BAC 11416E/17441E zeigt an normalen
Interphasekernen (46,XY) zwei Signale (rot). Die beiden Signale weisen darauf hin, dass der Bereich 22q11 vorhanden ist.
B) Die BACs 11416E/17441E (rot) zeigen distinkte Signale an den Chromosomen 22q11 (Pfeil).
C) DAPI-Invertierung der Metaphase in B).
Direkt markierte Sonden DNA von BAC 11416E und 17441E wurde in einer Menge von 500 ng/15 µl Hybridisierungslösung an unbehandelten Objektträgern eingesetzt. Wie in Abbildung 4-7 gezeigt, sind für die Sondenkombination distinkte Signale in Interphasekernen und an Metaphasechromosomen zu erkennen.