2. EKSPERIMENTAALNE OSA
2.3 Tulemused ja arutelu
2.3.5 CHO-S GS KO rakukloonide fenotüübi kirjeldamine
Et kinnitada antud CHO-S GS KO rakukloonide elumuse sõltuvust glutamiinist, mis on lõpliku väljavalitud rakuliini oluline omadus GS põhise selektsioonisüsteemi rakendamisel (transfekteerumata rakud surevad eksogeense glutamiini puudumisel), kasvatati rakukloone suspensioonikultuuride korral rutiinselt kasutatavates 125 ml loksutuskolbides. Samuti võib leida kirjandusest andmeid, kus esmane glutamiinisõltuval fenotüübil põhinev skriining viidi läbi samuti 6-süvendilise plaadi formaadis, kuid hiljem loksutuskolbides kultiveerides osade rakukloonide puhul glutamiinist sõltuvat kasvu enam ei täheldatud (Fan jt., 2011). Seega on oluline veenduda antud rakukloonide glutamiinisõltuvas fenotüübis.
Väljavalitud üheksa GS KO kloonide kasvu ja elumust jälgiti glutamiini sisaldavas ja glutamiinivabas söötmes, kasvatades neid rutiinselt kasutatavates 125 ml loksutuskolbides.
Kloonide kasvu jälgiti kuni nende hukkumiseni. Iga 2 – 3 päeva järel määrati rakukultuuride elumus (elusate rakkude suhe rakkude üldarvu), kasutades Brükeri hemotsütomeetrit ning rakukultuurid lahjendati tiheduseni 3 – 5x105 elusat rakku milliliitris. Jooniselt 10A võib näha, et kõigi CHO-S GS KO rakukloonide elumus hakkas järsult langema pärast 2. päeva, rakud ei
36
jagunenud enam ning samuti oli märgatavalt vähenenud rakkude suurus. 7. – 10. päevaks oli elumus langenud ligikaudu 0%-ni ehk rakud olid surnud. Seevastu funktsionaalse GS geeniga metsiktüüpi CHO-S rakuliin kasvas edukalt ka glutamiinivabas söötmes. Kui söötmesse oli lisatud glutamiini, püsis GS KO rakukloonide elumus ligikaudu 100% juures (joonis 10B), viidates tugevale glutamiini auksotroofsusele.
37
Joonis 11. CHO-S GS KO rakukloonide elumuse sõltuvust eksogeensest glutamiinist. Näidatud on valitud rakukloonide elumus kasvatamisel ilma eksogeense glutamiinita (A) ja 8 mM glutamiiniga (B) söötmes 125 ml loksutuskolvis (Corning). Kümne päeva vältel määrati iga 2 – 3 päeva järel hemotsütomeeteri abil rakukultuuri tihedus ja elumus (elusate rakkude suhe rakkude üldarvu x 100%) ning aktiivse kasvufaasi säilitamiseks vajadusel kultuure lahjendatitiheduseni 3 – 5x105 elusat rakku milliliitris. Elusate ja surnud rakkude eristamiseks värviti surnud rakud 0,4% trüpaansinise lahusega (Gibco). CHO-S wt tähistab funktsionaalse GS geeniga metsiktüüpi CHO-S rakuliini.
38
Seega kokkuvõtvalt isoleeriti ja iseloomustati antud bakalaureusetöö raames üheksa CHO-S GS KO rakuliini, millest kaheksa korral (20C3, 11E3, 11G6, 11G9, 5C10.2, 21C3, 2C8 ja 13D2) oli võimalik GS geeni 2. või 4. eksonis tuvastada CRISPR/Cas9 süsteemi poolt indutseeritud raaminihet tekitavaid modifikatsioone, mis rikuvad GS valgu ekspressiooni ning seetõttu ei ole rakud võimelised glutamiinivabas söötmes kasvama. Kuigi rakuliini 20G1 korral GS valgu ekspressiooni ei olnud võimalik detekteetrida WB meetodiga ning rakkude kasv oli tugevalt glutamiinisõltuv, lõputöös kasutatud praimeripaaridega PCR produkti ei tekkinud ning antud rakukloon vajab GS KO genotüübi osas verifitseerimist. Kuigi GS põhise selektsioonisüsteemi rakendamisel on rakkude glutamiini auksotroofsus esmatähtis kriteerium, sest see võimaldab kasutada eksogeenset GS geeni selektsioonimarkerina, on praktilises valkude tootmises olulised ka rakuliini muud omadused. Näiteks võib välja tuua sekreteeritavate rekombinantsete valkude (näiteks antikehade) üldise produktsioonivõimekuse, mis oleneb paljudest faktoritest nagu näiteks rakkude sekretsioonivõimest (rekombinantne valk sekreteeritakse rakust välja söötmesse), mis tuleneb tsütoplasmavõrgustiku omadustest; rakkude energiavarustatusest, mis sõltub nt mitokondrite massist; rakukultuuri maksimum tihedusest, mille juures rakud suudavad kasvada (st mida rohkem on rakke, seda suurem on rekombinantse valgu üldine tootlikkus) jne.
Ehkki kõik isoleeritud GS KO rakukloonid pärinevad samast CHO-S eellasliinist, võivad need erineda üksteisest oluliselt eelnimetatud tegurite osas, kuna CHO rakuliini muutlikkus ja heterogeensus on märkimisväärne (Pilbrough jt., 2009) (Pichler jt., 2010). Seega lõpliku valiku tegemisel oleks järgmiseks etapiks võrrelda CHO-S GS KO rakuliinide erinevate rekombinantsete valkude produktsioonivõimekust. Selleks transfekteeritakse rakke ekspressioonivektoritega, milles on lisaks GS selektsioonimarkerile ka huvipakkuva rekombinantse valgu ekspressioonikassett. Seega eeldatavalt ekspresseerivad selektsioonimarkeri omandanud ja GS selektsioonis ellujäänud rakud lisaks selektsioonimarkerile ka huvipakkuvat rekombinantset valku. Huvipakkuva valgu tootlikkuse ja saaduse kvaliteedi iseloomustamise põhjal on võimalik välja selekteerida enim eelistatud CHO-S GS KO rakuliinid edasiseks produtsentrakuliinide arendamiseks.
39
KOKKUVÕTE
Käesoleva bakalaureusetöö eesmärk oli arendada mittefunktsionaalse glutamiini süntetaasi geeniga CHO-s rakuliin tõhusamaks super-produtsent rakuliinide arendamiseks. Kirjanduse ülevaates tutvustati imetaja rakuliinide rolli terapeutiliste valkude tootmises ning laialdast kasutust leidnud CHO rakuliini eeliseid.
Bakalaureusetöö eksperimentaalses osas keskenduti hiina hamstri munasarja rakkude glutamiini süntetaasi knockout (KO) rakuliini arendusele. Lõputöös kasutati glul geeni väljalülitamiseks CRISPR/Cas9 süsteemi. Selleks disainiti geeni glul eksonites asuvate sihtmärkjärjestuse spetsiifilsed gRNAd, mis kompleksis Cas9 valguga transfekteeriti CHO rakkudesse elektroporatsiooni meetodiga. Seejärel isoleeriti CHO-S GS KO rakukloonid, mis ei suutnud kasvada, kui söötmesse ei lisatud glutamiini. Väljavalitud rakukloonides kirjeldati toimunud mutatsioonid ning hinnati nende sobivust GS põhise selektsioonisüsteemi rakendamiseks. Bakalaureusetöö eksperimentaalses osas jõuti järgmistele järeldustele:
• disainitud gRNAd olid glul geeni spetsiifilised ja funktsionaalsed, indutseerides mutatsioonide teket. Seda kinnitas T7 endonukleaas I analüüs, mis näitas kõigi valitud gRNA kombinatsioonide sihtmärkjärjestuse spetsiifilisust ning Cas9 võimet tekitada katkeid sihtmärk-DNA järjestuses;
• antud bakalaurusetöö raames isoleeriti fenotüübi põhjal 90 potentsiaalset CHO-S GS KO rakuklooni. Edasiseks iseloomustamiseks valiti välja üheksa klooni, millest kaheksa puhul (20C3, 11E3, 11G6, 11G9, 5C10.2, 21C3, 2C8 ja 13D2) oli võimalik sekveneerimise meetodil tuvastada GS geeni 2. või 4. eksonis raaminihet tekitavaid modifikatsioone;
• kirjeldatud rakukloonid ei olnud võimelised kasvama eksogeenset glutamiini mittesisaldavas söötmes, kinnitades nende sobivust GS põhise selektsioonisüsteemi rakendamiseks.
40
Glutamine synthetase gene knockout in Chinese hamster ovary (Cricetulus griseus) cell line
Signe Parts Summary
Chinese hamster ovary (CHO) cells have become more popular for the manufacture of therapeutic recombinant proteins. To develope highly efficient producer cell lines, efficient, selection systems are required. Glutamine synthetase (GS) selection system is one commonly used in combination with GS inhibitor methionine sulfoximine (MSX).
Glutamine is one of the essential amino acids for cultivated CHO cells and the cells express endogenous GS. genewhich makes selection systems based on GS inhibitor MSX. In previous studies, it has been shown that adaption of the endogenous GS expressing cells in the presence of MSX results also survival of the cells with lower protein productivity Thus, the CHO cell lines with GSknockout can improve such metabolic selectionand makes the isolation of high level produceing cell clones more effective.
In this study we disrupted glutamine synthetase gene (glul) with CRISPR/Cas9 in CHO-S cell line as the first step in development of stable super-producent cell lines. To make GS gene inactive we transfected CHO-S cells by electroporation with Cas9 comlexed with glul specific gRNAs . Specific activity of Cas9/gRNA complex to glul was confirmed with T7 endonuclease I assay. To isolate cells with defective GS gene from the ones with functional GS, single cell derived clones were analyzed for exogenous glutamine dependendent growth. Next, the selected clones were analyzed for CRISPR/Cas9 mediated genome mutagenesis For further description of the GS-knockout clones we observed their glutamine-dependent growth in 125 ml flasks and absence of GS protein expression was also confirmed with Western blot analysis.
41
Tänusõnad
Soovin tänada oma juhendajat Eva-Maria Tombakut suurepärase juhendamise eest katsete läbiviimisel ja heade nõuannete eest nii laboris kui ka lõputöö kirjutamisel. Samuti soovin tänada juhendajat Andres Männikut, kes oli suureks abiks lõputöö valmimisel ning juhendajat Mart Ustavit, kes andis mulle imelise võimaluse teha bakalaureusetöö Icosagen Cell Factory OÜ’s. Tänan ka Icosageni meeskonda meeldiva koostöö ning abivalmiduse eest.
42
KIRJANDUSE LOETELU
Barrangou, R. (2015). The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond.
Current Opinion in Immunology, 32, lk 36-41. doi: 10.1016/j.coi.2014.12.008
Blanco, A. ja Blanco, G. (2017). Amino Acid Metabolism. rmt: Medical Biochemistry (lk 367-399). Elsevier Inc.
Burroughs, A. M., Balaji, S. ja Iyer, L. M. jt. (2007). Small but versatile: the extraordinary functional and structural diversity of the β-grasp fold. Biol Direct, 2(18).
doi:10.1186/1745-6150-2-18
Chusainow, J. Y. (2009). A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines: What makes a stable high producer? Biotechnology and Bioengineering, 102(4), lk 1182-1196. doi:10.1002/bit.22158
Crossley, K. K., Albee, A., Fuhr, B. ja Caple, M. (2010). New Advanced Protein-Free, Animal Component-Free Medium for Recombinant Protein Expression in Adherent CHO Cell Cultures. rmt: E. Lindner-Olsson, N. Chatzissavidou ja E. Lüllau, Animal Cell Technology: From Target to Market (Kd. 1, lk 189-192). Springer, Dordrecht. doi:
10.1007/978-94-010-0369-8_41
Edmonds, M. C., Tellers, M., Chan, C., Salmon, P., Robinson, D. K. ja Markusen, J. (2006).
Development of Transfection and High-Producer Screening Protocols for the CHOK1SV Cell System. Molecular Biotechnology, 34, lk 179-190.
doi:10.1385/mb:34:2:179
Eelen, G. D. (2018). Role of glutamine synthetase in angiogenesis beyond glutamine synthesis.
Nature, 561, lk 63-69. doi: 10.1038/s41586-018-0466-7
Fan, L., Frye, C. C. ja Rachel, A. J. (2013). The use of glutamine synthetase as a selection marker: recent advances in Chinese hamster ovary cell line generation processes.
Pharm. Bioprocess, 1(5), lk 487–502.
Fan, L., Kadura, I., Krebs, L. E., Hatfield, C. C., Shaw, M. M. ja Frye, C. C. (2011). Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells. Biotechnology and Bioengineering, 109(4). doi: 10.1002/bit.24365
43
Fernandez, C. R. (2018). CRISPR-Cas9: How this Gene Editing Tool is Changing the World.
Kasutamise kuupäev: 23. oktoober 2019. a., allikas Laboitech.eu:
https://www.labiotech.eu/features/crispr-cas9-review-gene-editing-tool/
Grav, L. M., Karottki, K. J., Lee, J. S. ja Kildegaard, H. F. (2017). Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing to Improve Recombinant Protein Production in CHO Cells. rmt: P.
Meleady (Toim.), Heterologous Protein Production in CHO Cells (lk 101-118).
Humana Press, New York, NY. doi:10.1007/978-1-4939-6972-2_7
Guschin D. Y., Waite A. J, Katibah G. E., Miller J. C., Holmes M. C. ja Rebar E. J. (2010). A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol, 649, 247‐256. doi:10.1007/978-1-60761-753-2_15.
Heinaru, A. (2014). Geneetika. Tartu: Tartu Ülikooli Kirjastus. Allikas: http://geneetika.ee/wp-content/uploads/2014/09/Geneetika-XX-osa-A.-Heinaru.pdf
Huertas, P. (2010.). DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology, 17(1), lk 11-16. doi:10.1038/nsmb.1710
Jedrzejczak-Silicka, M. (2017). History of Cell Culture. rmt: S. J. Gowde, New Insights into Cell Culture Technology. IntechOpen. doi:10.5772/66905
Kaufmann, S. H. (2017). Remembering Emil von Behring: from Tetanus Treatment to Antibody Cooperation with Phagocytes. mBio, 8(1). Allikas: https://doi.org/10.1128/
Kim, J., Kim, Y. ja Lee, G. M. (2012). CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol, 93, lk 917-930. DOI: 10.1007/s00253-011-3758-5
Kim, T. K. ja Eberwine, J. H. (2010). Mammalian cell transfection: the present and the future.
Analytical and Bioanalytical Chemistry, lk 3173–3178. doi:10.1007/s00216-010-3821-6
L. Vouillot, A.Thélie ja N. Pollet (2015). Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3 (Bethesda), 5(3), 407‐415. doi:10.1534/g3.114.015834
Lagassé, H. A., Alexaki, A., Simhadri, V. L., Katagiri, N. H., Jankowski, W., Sauna, Z. E. ja Kimchi-Sarfaty, C. (2017). Recent advances in (therapeutic protein) drug development.
F1000 Research, 6(113). doi:10.12688/f1000research.9970.1
44
Lai, T., Yang, Y. ja Ng, S. (2013). Advances in Mammalian Cell Line Development Technologies for Recombinant Protein Production. Pharmaceuticals, 6(5), lk 579–603.
doi:10.3390/ph6050579
Lee, J. S., Grav, L. M., Lewis, N. E. ja Kildegaard, H. F. (2015). CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of CHO cell. Biotechnology Journal, 979-994.
doi:10.1002/biot.201500082
Lewis, N., Liu, X. ja Li, Y. (2013). Genomic landscapes of Chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome. Nature Biotechnology, 21, 759-765.
doi:https://doi.org/10.1038/nbt.2624
Fan L., Frye1 C. C. ja Racher A. J. (2013). The use of glutamine synthetase as a selection marker: recent advances in Chinese hamster ovary cell line generation processes.
Pharmaceutical Bioprocessing, 1(5), 487-502. doi:10.4155/PBP.13.56
Lin, P. C., Chan K. F., Kiess I. A., Tan J., Shahreel W., Wong S. Y. ja Song Z. ( 2019).
Attenuated glutamine synthetase as a selection marker in CHO cells to efficiently isolate highly productive stable cells for the production of antibodies and other biologics.
mAbs, 11(5), 965-976. doi:10.1080/19420862.2019.1612690
Mashal R. D., Koontz J. ja Sklar J. (1995). Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nat Genet, 9(2), 177-183. doi:
10.1038/ng0295-177
Mignon, C., Sodoyer, R. ja Werle, B. (2015). Antibiotic-Free Selection in Biotherapeutics: Now and Forever. Pathogens, 4(2), lk 157-181. doi:10.3390/pathogens4020157
Molecular Devices. The evolution of CHO cells’ role. Kasutamise kuupäev: 18. mai 2020. a., allikas increased specific antibody production rates by repeated cycles of transient transfection and cell sorting. Biotechnology and Bioengineering, 108(2).
doi:https://doi.org/10.1002/bit.22946
45
Pilbrough, W., Munro, T. P. ja Gray, P. (2009). Intraclonal Protein Expression Heterogeneity in Recombinant CHO Cells. PLoS One, 4(12). doi:10.1371/journal.pone.0008432 Pohl, H. (2020). What are the Advantages of Using Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells? Enzo
Life Sciences. Allikas: https://www.enzolifesciences.com/science- center/technotes/2020/march/what-are-the-advantages-of-using-chinese-hamster-ovary-(cho)-cells?/
Rainey P. B., Heithoff D. M. ja Mahan M. J. (1997). Single-step conjugative cloning of bacterial gene fusion involved in microbe-host interaction. Mol. Gen. Genet, 256 (1), 84-87. doi: 10.1007/s004380050548.
Reis, A., Hornblower, B., Robb, B. ja Tzertzinis, G. (2014). CRISPR/Cas9 & Targeted Genome Editing: New Era in Molecular Biology. NEB expressions Issue I, 3-5. Kasutamise kuupäev: 28. oktoober 2019. a., allikas New England Biolabs:
https://international.neb.com/-/media/nebus/files/brochures/expressions_issuei_2014.pdf?rev=8d032f71892b40ea87 4b675352e1ab6e
Ronzio, R. A. ja Meister, A. (1968). Phosphorylation of methionine sulfoximine by glutamine synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences, 59(1), lk 164–170.
doi:10.1073/pnas.59.1.164
Sanders, P. ja Wilson, R. (1984). Amplification and cloning of the Chinese hamster glutamine synthetase gene. EMBO J, 3(1), 65‐71.
Shah, S. A., Erdmann, S., Mojica, F. J. ja Garrett, R. A. (2013). Protospacer recognition motifs:
Mixed identities and functional diversity. RNA Biology, 10(5), lk 891-899. Allikas: How To Use CRISPR: Your Guide to Successful Genome Engineering:
https://www.synthego.com/guide/how-to-use-crispr/design-grna-crispr
STEMCELL Technologies. (2008). Evaluation of Genome Editing. TECHNICAL BULLETIN.
Kasutamise kuupäev: 1. juuni 2020. a., allikas https://www.stemcell.com/evaluation-of-genome-editing.html
Strohl, W. R. ja Strohl, L. M. (2012). Cell line development. rmt: W. R. Strohl ja L. M. Strohl, Therapeutic Antibody Engineering (lk 421-595). Woodhead Publishing.
46
Thurtle‐Schmidt, D. M. ja Lo, T.-W. (2018). Molecular biology at the cutting edge: A review on CRISPR/CAS9 gene editing for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education, 46(2). doi:10.1002/bmb.21108
Truett G. E, Heeger P., Mynatt R. L., Truett A. A., Walker J. A. ja Warman M. L. (2000).
Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques, 29(1), 52‐54. doi:10.2144/00291bm09
Weatherburn, D. C., Mandal, S., S.Mukhopadhyay, Bhaduri, S. ja Lindoy, L. F. (2003). Amino Acid Metabolism. rmt: Comprehensive Coordination Chemistry II (5, lk 1-125).
Elsevier Science.
Wu, X., Kriz, A. J. ja Sharp, P. A. (2014). Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.
Quantitative Biology, 2, lk 59-70.
Wurm, F. (2013). CHO Quasispecies—Implications for Manufacturing Processes. Processes, 1(3), lk 296–311. doi:10.3390/pr1030296
Wurm, F. M. (2004). Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology, 22(11), 1393–1398. doi:10.1038/nbt1026
Xu, J., Rehmann, M. S., Xu, M., Zheng, S., Hill, C., He, Q., . . . Li, Z. J. (2020). Development of an intensified fed-batch production platform with doubled titers using N-1 perfusion seed for cell culture manufacturing. Bioresources and Bioprocessing, 11(5).
KASUTATUD VEEBIAADRESSID
1. UNIPROT https://www.uniprot.org/uniprot/P04773 (kasutatud 7.06.2020) 2. CRISPOR tööriist http://crispor.tefor.net/ (kasutatud 7.06.2020)
3. CRISPR Design Tool https://design.synthego.com/ (kasutatud 7.06.2020) 4. Verify Guide Design Tool https://design.synthego.com/#/validate (kasutatud
7.06.2020)
5. NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100764163 (Kasutatud 7.06.2020)
47
LIHTLITSENTS
Lihtlitsents lõputöö reprodutseerimiseks ja üldsusele kättesaadavaks tegemiseks
Mina, Signe Parts
1. annan Tartu Ülikoolile tasuta loa (lihtlitsentsi) minu loodud teose
„Glutamiini süntetaasi geeni väljalülitamine hiina hamstri (Cricetulus griseus) munasarja rakuliinis“,
mille juhendajad on Mart Ustav, Eva-Maria Tombak ja Andres Männik,
reprodutseerimiseks eesmärgiga seda säilitada, sealhulgas lisada digitaalarhiivi DSpace kuni autoriõiguse kehtivuse lõppemiseni.
2. Annan Tartu Ülikoolile loa teha punktis 1 nimetatud teos üldsusele kättesaadavaks Tartu Ülikooli veebikeskkonna, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace kaudu Creative Commonsi litsentsiga CC BY NC ND 3.0, mis lubab autorile viidates teost reprodutseerida, levitada ja üldsusele suunata ning keelab luua tuletatud teost ja kasutada teost ärieesmärgil, kuni autoriõiguse kehtivuse lõppemiseni.
3. Olen teadlik, et punktides 1 ja 2 nimetatud õigused jäävad alles ka autorile.
4. Kinnitan, et lihtlitsentsi andmisega ei riku ma teiste isikute intellektuaalomandi ega isikuandmete kaitse õigusaktidest tulenevaid õigusi.
Signe Parts
07.06.2020