Sowohl bei Aktivierung von CheY2 als auch bei der Wechselwirkung von CheY2 und CheY2-BeF3 mit der P2-Dom¨ane von CheA wurden das Aktive Zentrum (
”saure Ta-sche“) und der C-terminale Bereich (α4, β4, α5) der Proteine wesentlich beeinflußt.
Die beiden im aktiven Zentrum gelegenen Punktmutationen Asp14Lys und Asn60Arg sowie der Austausch Val107Trp im C-terminalen Bereich wurden von K. Fuchs [160]
biochemisch charakterisiert. Die r¨aumliche Lage dieser Mutationsstellen in der CheY2-Struktur ist in Abb. 3.16 anhand des B¨andermodells von CheY2 verdeutlicht.
Die Punktmutation Val107Trp f¨uhrt zu einer stark reduzierten Bindung an den Flagel-lenmotor, die Phosphorylierung ist jedoch kaum beeintr¨achtigt. Das Mutantenprotein CheY2-D14K besitzt eine permanent aktive Konformation, kann also stets an den Motor binden, wird jedoch nicht phosphoryliert. CheY2-N60R bindet an den Flagellenmotor und ist phosphorylierbar. Der phosphatgebundene Zustand besitzt im Vergleich zu CheY2 eine deutlich erh¨ohte Halbwertszeit (B. Scharf, pers. Mitteilung). Die Mutan-tenproteine CheY2-V107W, CheY2-D14K und CheY2-N60R besitzen also im Hinblick auf Motorbindung und Phosphorylierung interessante Eigenschaften und wurden daher mittels NMR-Spektroskopie weitergehend untersucht.
Abb. 3.16: B¨andermodell von CheY2.
Die funktionell wichtigen Aminos¨ aure-reste Asp14 und Asn60, die im aktiven Zentrum lokalisiert sind, sowie der Rest Val107, der im C-terminalen Bereich (α4,β5,α5) aufβ-Strang f¨unf liegt, sind hervorgehoben und bezeichnet.
3.6.1 CheY2-V107W
Der Valinrest in Position 107 in CheY2 ist wichtig f¨ur die Bindung an den Motor. Bei vergleichbaren Responsregulatoren findet sich in dieser Position immer ein aromatischer Aminos¨aurerest. Bei E. coli-CheY ist dieser Rest (Tyr 106) entscheidend f¨ur die Bin-dung an den Flagellenmotor (Y-T-Kopplung; 1.3.1). CheY2 von S.meliloti besitzt kei-nen analogen Y-T-Kopplungsmechanismus. Aufgrund dieser m¨oglicherweise funktionell wichtigen Unterschiede in der Motorbindung und -steuerung sollte das Mutantenprotein CheY2-V107W von S. meliloti genauer untersucht werden.
Der Vergleich des HSQC-Spektrums von CheY2-V107W mit dem von CheY2 und auch CheY2-BeF3 zeigte, daß viele Signale wesentlich verschoben waren. Eine eindeutige Ubertragung der Zuordnung war nur f¨¨ ur etwa 40% der Signale m¨oglich. Aus diesem Grund war eine quantitative Charakterisierung dieser Mutante ( z.B. mittels chemical shift mapping) nicht m¨oglich. Mg++-Komplexierung im aktiven Zentrum von CheY2 ist essentiell f¨ur dessen Phosphorylierung. Um eine niedrigere Mg++-Affinit¨at als Ursache f¨ur dieses Ergebnis auszuschließen wurde eine Mg++-Titrationsreihe ¨uber einen Konzen-trationsbereich von 5 mM bis 100 mM MgCl2 durchgef¨uhrt. Da keine Ver¨anderungen in den Spektren beobachtet wurden kann eine verringerte Mg++-Affinit¨at ausgeschlossen werden, sofern Mg++ uberhaupt komplexiert wird. Letzteres ist aber anzunehmen, da¨ die Mutante phosphoryliert werden kann [160]. Die Analyse der aufgenommenen Spek-tren zeigte, daß das Protein gefaltet und nicht denaturiert in der NMR-Probe vorlag.
Wegen der großen Differenzen zum HSQC-Spektrum von CheY2 und CheY2-BeF3 konn-ten keine sequenzspezifischen Aussagen getroffen werden. Jedoch weisen die Dakonn-ten auf gr¨oßere konformationelle Unterschiede hin, die Ursache der ver¨anderten Motorbindung sein k¨onnten. Dies zeigt auch, daß der C-terminale Oberfl¨achenbereich von CheY2 die Bindung an den Motor wesentlich beeinflußt.
3.6.2 CheY2-D14K
Der Austausch des nahe am aktiven Zentrum gelegenen Aminos¨aurerestes Asp14 durch Lys f¨uhrt zu einer permanent aktivierten Form von CheY2 [160], die nicht mehr phospho-ryliert werden kann. Das HSQC-Spektrum von CheY2 D14K zeigte wenig ¨Ahnlichkeit zu dem von CheY2-BeF3 . Jedoch konnte durch Vergleich mit dem relativ ¨ahnlichen HSQC-Spektrum von CheY2 eine fast vollst¨andige und eindeutige Zuordnung der Signa-le erreicht werden. Lediglich die Aminos¨aurereste Gly40, Ala89 und Glu115 wurden im HSQC-Spektrum der CheY2-D14K Mutante nicht identifiziert, auch nicht durch Ver-gleich mit den Daten von CheY2-BeF3 . An der Stelle des mutierten Aminos¨aurerests Asp 14 wurde kein Signal beobachtet. Dies spricht erstens f¨ur die Stimmigkeit der CheY2-Zuordnung, zweitens f¨ur lokale, chemische und strukturelle Ver¨anderungen in dem Mutantenprotein. Die sequenzspezifischen chemischen Verschiebungsunterschiede
∆ppmg(1H,15N) (2.10) zwischen den HSQC-Spektren von CheY2 und CheY2-D14K sind als Histogramm in Abb. 3.17 dargestellt.
Abb. 3.17: Sequenzspezifische chemische Verschiebungsunterschiede
∆ppmg(1H,15N) zwischen CheY2 und der Mutante CheY2- D14K. : Mutationsstelle; : Prolinreste;
Die Verschiebungs¨anderung war f¨ur 1H- bzw. 15N-Atome maximal 0,45 ppm bzw. 1,6 ppm. Alle Reste, deren chemische Verschiebungs¨anderungen ¨uber dem Niveau von 0,52 ppm (doppelte Standardabweichung) liegt, sind in der B¨anderdarstellung von Abbildung 3.18 (A) orange gef¨arbt. In der Umgebung der D14K Mutation sind in naheliegender Weise lokale Verschiebungs¨anderungen zu beobachten. Desweiteren induziert die Muta-tion in r¨aumlich entfernten Bereichen signifikante chemische Verschiebungs¨anderungen.
Diese sind im N-terminalen Bereich von α2, in β3, und in den C-terminal gelegenen Sekund¨arstrukturelementen α4,β5 und α5 lokalisiert.
In Abb. 3.18 (B) ist eine C-terminale Aufsicht auf das CPK-Modell von CheY2 darge-stellt. Signifikant beeinflußte und oberfl¨achennahe Aminos¨aurereste sind orange gef¨arbt und bezeichnet. Auf der nicht gezeigten Proteinoberfl¨ache wurden keine Effekte beob-achtet. Im wesentlichen k¨onnen zwei gr¨oßere Bereiche identifiziert werden. Erstens das
Abb. 3.18: (A) B¨andermodell von CheY2. Reste mit signifikanten che-mischen Verschiebungsunterschieden > 0,52 ppm zwischen CheY2 und der Mutante CheY2-D14K sind orange gef¨arbt. (B) CPK-Darstellung von CheY2 in C-terminaler Aufsicht auf die Proteinoberfl¨ache. Nahe der Proteinoberfl¨ache liegende Aminos¨aurereste, die durch die Mutation Asp14Lys signifikant beeinflußt wurden, sind farblich hervorgehoben und gekennzeichnet.
aktive Zentrum, das die Mutationsstelle enth¨alt (Gln15, Lys16, Ser18, Asn60, Lys63) und zweitens eine C-terminal gelegener zusammenh¨angender Bereich, der die Reste Gly91, Arg93, Ala94, Asn106, Leu108, Ala109, Gly126 und Ala127 enth¨alt. Einige der letztgenannten Reste (Gly91, Arg93, Asn106, Gly126) wurden auch bei Aktivie-rung und/oder P2-Bindung signifikant beeinflußt. Aufgrund dieser Ergebnisse, in Kom-bination mit den Eigenschaften der Mutante CheY2-D14K (keine Phosphorylierung, verst¨arkte Motorbindung) ist eine der aktiven Form von CheY2 analoge, von der Phos-phorylierung unabh¨angige, Konformation der C-terminal gelegenen Motorbindungsstel-le anzunehmen. F¨ur eine C-terminal gelegene Motorbindungsstelle spricht auch eine stark verringerte Affinit¨at zum Motor durch die C-terminal inβ-Strang f¨unf eingef¨uhrte Punktmutation Val107Trp.
3.6.3 CheY2-N60R
Die Mutation von Asn60Arg f¨uhrt bei CheY2 zu einer permanent aktivierten Konforma-tion [160]. CheY2-N60R kann durch CheA phosphoryliert werden. Der
phosphatgebun-dene Zustand besitzt jedoch im Vergleich zu CheY2 eine deutlich erh¨ohte Halbwertszeit (pers. Mitteilung von Dr. B. Scharf), ist also stabiler. Asn 60 liegt im Bereich der Phosphat- (Asp 58) und Mg++-Bindungsstelle (Asp 13, 14). Aufgrund Phosphorylie-rungseigenschaften und des zu CheY2-D14K ¨ahnlichen Ph¨anotyps wurde diese Mutante mittels NMR-Spektroskopie untersucht. Das HSQC-Spektrum von CheY2-N60R wurde durch Vergleich mit dem von CheY2 zugeordnet. Außer den Resten Asp58, Phe59, Leu87 und Ala89 wurden alle Signale identifiziert. Das fehlende Signal von Asn 60 ist ein Indiz f¨ur die Richtigkeit der Zuordnung. Eine Erg¨anzung der fehlenden Zuordnungen war nicht durch Vergleich mit dem HSQC-Spektrum von CheY2-BeF3 m¨oglich. Abbildung 3.19 zeigt die sequenzspezifischen chemischen Verschiebungsunterschiede ∆ppmg(1H,15N) (2.10) zwischen den CheY2-N60R- und CheY2-HSQC-Spektren.
Abb. 3.19: Sequenzspezifische chemische Verschiebungsunterschiede
∆ppmg(1H,15N) zwischen CheY2 und der Mutante CheY2- N60R. : Mutationsstelle; : Prolinreste;
Die maximalen chemischen Verschiebungsunterschiede f¨ur 1H- bzw. 15N-Atome lagen bei 0,43 ppm bzw. 1,9 ppm. F¨ur Reste, deren chemische Verschiebungsunterschiede gr¨oßer sind als die doppelte Standardabweichung 0,38 ppm sind durch die Mutation signifikant beeinflußt. Die Verteilung dieser Reste (Asp14, Ser18, Met44, Met61, Met64, Gly66, Thr88, Gly91, Leu108) ¨uber die Terti¨arstruktur ist in der B¨anderdarstellung von CheY2 in Abb. 3.20 (A) gegeben. Die signifikant beeinflußten Aminos¨aurereste sind dort orange gef¨arbt. Die beeinflußten Reste sind im Bereich der Mutation, des r¨aumlich nahen aktiven Zentrums, in α4 und β5 lokalisiert, jedoch weniger ausgepr¨agt als beim Mutantenprotein CheY2-D14K.
Das CPK-Modell von CheY2 in Abb. 3.20 (B) zeigt die C-terminale Aufsicht auf die Pro-teinoberfl¨ache. Signifikant beeinflußte und oberfl¨achennahe Reste sind orange gef¨arbt.
Die Auswirkungen der Mutation auf die Gesamtstruktur ist mit Ausnahme der Mutati-onsstelle im Vergleich CheY2-D14K sehr gering. Zusammen mit den Eigenschaften von CheY2-N60R (phosphorylierbar, hohe Stabilit¨at des phosphorylierten Zustands) kann angenommen werden, daß (i) die Mutation die Ursache der festeren Phosphatbindung ist und (ii) der f¨ur die Motorbindung erforderliche Konformatinswechsel durch Phos-phorylierung und nicht alleine durch die Mutation induziert wird.
Abb. 3.20: (A) B¨anderdarstellung von CheY2. Reste mit signifikan-ten chemischen Verschiebungsunterschieden > 0,38 ppm im Vergleich zur Mutante CheY2-N60R sind orange gef¨arbt. (B) CPK-Darstellung von CheY2 in C-terminaler Aufsicht auf die Proteinoberfl¨ache. In N¨ahe der Proteinoberfl¨ache gelegene Aminos¨aurereste, die durch die Mutation Asn60Arg signifikant beeinflußt wurden, sind hervorgehoben.
Insgesamt kann aus den Ergebnissen der Mutantenproteine V107W, CheY2-D14K und CheY2-N60R gefolgert werden, daß (i) die Motorbindungsfl¨ache in CheY2 C-terminal lokalisiert ist und (ii) Phosphorylierung und Motorbindung entkoppelt sind, d.h. Phosphorylierung ist keine notwendige Voraussetzung f¨ur die Bindung von CheY2 an den Motor.