7 DISKUSSION
7.4 Charakterisierung der T- und NK-Zellen in TIL und NIL
Wie bereits erwähnt, konnte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Degranulationstests gezeigt werden, dass direkt aus dem Tumor isolierte CD3+CD8+ und NK-Zellen eine sehr geringe Degranulationsaktivität aufweisen. Damit wurden die zuvor mit Hilfe des 4 Std.
Chromfreisetzungstest erworbenen Daten (Schleypen et al., 2006), die einen Mangel an lytischer Aktivität gezeigt hatten, mit einem neuen Test, der direkt die Aktivität der
Effektorzellen abfragt, bestätigt. Der CD107-Mobilisierungstest ermöglicht direkt die funktionelle Kapazität bzw. funktioneller Inaktivierung der Effektorzellen abzufragen. Da die T-Zellen mit anti-CD3-Antikörpern, welche an die P815-Zelllinie gekoppelt waren, und NK-Zellen mit der MHC-Klasse-I-negativen Zelllinie K562 stimuliert wurden, kann eine funktionelle Inaktivität nicht durch eine suboptimale Stimulation erklärt werden. Beim Nachweise der Degranulationsfähigkeit wurde nicht mit PMA/Ionomyzin stimuliert, um eine physiologische Stimulation nachzuahmen und auch Defekte, die direkt am TZR vorkommen können, nicht zu übersehen. Die Ergebnisse dieser Arbeit, als auch weitere Untersuchungen der Arbeitsgruppe zur Granulaexozytose in RCC-Gewebeschnitten, deuten darauf hin, dass die Lymphozyten im Tumorgewebe in einem funktionell inaktiven Zustand vorliegen. Die Effektorzellen der NIL dagegen zeigten im CD107-Oberflächenmobilisierungstest funktionelle Aktivität. Somit kann ausgeschlossen werden, dass die funktionelle Inaktivität der TIL durch die Isolierungsmethode induziert wurde. Vielmehr scheint eine spezifische, durch das Tumormilieu bedingte Inaktivierung vorzuliegen. Eine mögliche funktionelle Inaktivität der tumorinfiltrierenden Lymphozyten wurde bislang nur indirekt aus klinischen Beobachtungen abgeleitet, weil die Tumoren trotz einer hohen Anzahl an TIL nicht abgestoßen wurden.
Durch die hier erhobenen Daten wurde somit die funktionelle Inaktivität der tumorinfiltrierenden Lymphozyten direkt gezeigt. Desweiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die funktionelle Inaktivität isolierter TIL bereits durch eine zweitägige Aktivierung der TIL in niedrigdosiertem IL-2 aufgehoben werden kann; die Inaktivität der TIL ist demnach reversibel. In den hier untersuchten TIL war die funktionelle Aktivität nach der IL-2-Kultivierung bei den CD3+CD8+ Zellen der TIL im Median auf das 6-fache und bei den NK-Zellen der TIL auf das 4-fache im Vergleich zu den unbehandelten, nativen NK-Zellen angestiegen. Diese durch die IL-2-Kultivierung erworbene funktionelle Aktivität der NK-Zellen korrelierte mit dem Anteil der NK-Zellen innerhalb der Lymphozyten von unbehandelten TIL.
Schleypen et al zeigten (Schleypen et al., 2006), dass Zellen von TIL, die einen NK-Anteil von über 20 % aufweisen, lytische Aktivität gegenüber MHC-Klasse-I negativen Tumorzellen nach In-vitro-Kultivierung aufwiesen. Eine bestätigende Korrelation ergab sich, indem der Anteil der degranulierenden NK-Zellen nach IL-2-Kultivierung mit dem Prozentsatz der NK-Zellen in unkultivierten TIL korrelierte. Somit sind NK-Zellen in TIL, die einen hohen Anteil an NK-Zellen besitzen, außerhalb des Tumormilieus besser reaktivierbar. Auch der Anteil Perforin-positiver Zellen innerhalb der NK-Zellen in TIL im unbehandelten Zustand korrelierte mit der Fähigkeit zur CD107-Mobilisierung nach IL-2-Kultivierung. Offensichtlich sind NK-Zellen mit einem hohen Anteil Perforin-positiver Zellen weniger durch das Tumormilieu inhibiert und können die funktionelle Aktivität daher besser wieder erlangen. Mit drei TIL wurde eine Kultivierung ohne IL-2 durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass NK-Zellen kein IL-2 benötigten um die Fähigkeit zur Degranulation zu erlangen. Denkbar wäre, dass
inhibitorische Zellpopulationen verringert werden oder ganz verschwinden. So war im unkultivierten Zustand ein deutlich höherer Anteil an CD14+ Zellen in der Leukozytenpopulation der TIL enthalten als nach der IL-2-Kultivierung. Vermutlich adhärierten die CD14+ Zellen am Plattenboden, wurden nicht mitgeerntet und waren daher bei der Funktionsabfrage nicht anwesend. Weitere Untersuchungen (gezieltes Entfernen von Subpopulationen) sind nötig, um diese Vermutungen zu konkretisieren.
Die CD3+CD8+ Zellen in TIL hingegen benötigten IL-2 um Degranulationsfähigkeit zu erlangen. Ihre Degranulationsfäfhigkeit blieb ohne IL-2 deutlich unter dem Anteil der mit IL-2-kultivierten TIL (Daten nicht gezeigt). IL-2 könnte somit eine direkte Rolle bei der Reversion von Degranulationsdefekten der CD3+CD8+ Zellen der TIL spielen, indem diese direkt durch IL-2 aktiviert werden. Auch eine indirekte Rolle ist denkbar, indem andere Zellpopulationen, wie die NK-Zellen aktiviert werden, welche dann wiederum die funktionelle Aktivität der T-Zellen fördern könnten.
Die funktionelle Konsequenz einer Degranulation ist die lytische Aktivität. Dazu müssen die lytischen Granula mit den Zytotoxinen Perforin und Granzym B gefüllt sein, da diese eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Tumorzellen spielen und bei ihrer Abwesenheit Tumoren schneller wachsen (van den Broek et al., 1995; Smyth et al., 1999). Ein großer Anteil der CD8+ T- und NK-Zellen der TIL war Perforin- und Granzym B-negativ. Somit wäre, selbst wenn die Zellen degranulieren würden, eine Tumorabstoßung nicht zu erwarten.
Allerdings sind auch ZTL aus Perforin-knockout-Mäusen beschrieben, die Tumoren in vivo abstoßen (Seki et al., 2002). Wir konnten aber innerhalb der Arbeitsgruppe mit Hilfe unserer In-vitro-Systeme zeigen, dass ZTL, die Perforin-negativ gemacht wurden, nicht lytisch sind.
Dies konnte auch hier für die NK-Zellen bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass Perforin-reduzierte NK-Zellen unabhängig von der Granzym B-Expression Zielzellen nicht lysierten.
Dies zeigt zu mindestens in vitro die Bedeutung des Perforins für die Bekämpfung von Tumorzellen.
Durch IL-2-Kultivierung konnten Perforin- und Granzym B-Defizite revertiert werden.
Allerdings reichte eine bloße Kultivierung ohne IL-2 nicht aus, um die Perforin- und Granzym B-Expression in Zellen der TIL zu induzieren. Die Expression von Perforin war in NK-Zellen nach der Kultivierung der TIL ohne IL-2 sogar niedriger als im Ausganszustand und die Expression von Granzym B vergleichbar mit dem Ausgangszustand. Somit sind die NK-Zellen der TIL nach der Kultivierung ohne IL-2 zwar fähig zur Granulaexozytose aber vermutlich nicht lytisch. Dies soll in zukünftigen Experimenten getestet werden.
Auch bei den CD3+CD8+ Zellen der TIL blieb bei Kultivierung ohne IL-2 die deutliche Induktion der zytolytischen Proteine, wie sie bei der Kultivierung mit IL-2 beobachtet wurde, aus. Zwei der drei TIL zeigten doppelt so viele und ein TIL halb so viele Perforin-positive
CD3+CD8+ Zellen nach der Kultivierung ohne IL-2 im Vergleich zum Ausgangzustand. Die Granzym B Expression veränderte sich durch die Kultivierung ohne IL-2 nicht. Die Induktionen der zytolytischen Proteine in CD3+CD8+ Zellen der TIL benötigt IL-2 (Daten nicht gezeigt).
Ein weiterer Mechanismus des Tumormilieus eine Tumorzellzerstörung durch NK-Zellen zu verhindern, ist die Abregulation aktivierender NK-Zellrezeptoren. Bei den hier untersuchten TIL zeigte sich eine stark verminderte Population NKp46-positiver NK-Zellen. NKp46 ist der bedeutendste zytotoxizitätsvermittelnde Rezeptor (Sivori et al., 1999) und wichtig für die Tumorzellerkennung. Ein beschriebener Mechanismus, der zum Verlust des NKp46-Rezeptors führen kann, ist der Abbau von Tryptophan zu L-Kynurenin durch 2,3-Dioxygenase (IDO). Durch eine hohe IDO-Aktivität im Tumor wird das Abbauprodukt L-Kynurenin angereichert, welches die Expression von NKp46 inhibiert und das darüber vermittelte Abtöten von Tumorzellen (Della Chiesa et al., 2006). RCC-Zellen können in vitro IDO exprimieren (Riesenberg et al., 2007).
NKG2D ist ein weiterer aktivierender NK-Rezeptor. Seine Expression wir duch Ligandbindung (MICA/B) abreguliert und führt zu inhibierten NK-Zellen. Lösliche MICA-Liganden werden vom RCC produziert und dies soll ein immuninhibitorischer Mechanismus des Nierenzellkarzinoms sein. (Groh et al., 2002; Holdenrieder et al., 2006). Allerdings war hier eine NKG2D-Abregulation bei den NK-Zellen in TIL nicht nachzuweisen.
ZTL und NK-Zellen zeigten erhöhte Expression des CD69-Rezeptors, welcher als früher Aktivierungsmarker gilt. Gleichzeitig waren sie aber funktionsinhibiert. Da CD69 in CD8+ T- und NK-Zellen der TIL aber nicht der NIL erhöht war, scheinen für die Induktion von CD69 tumorassoziierte Faktoren verantwortlich zu sein. Die erhöhte CD69-Expression könnte durch chronische Aktivierung im Tumormilieu bedingt sein und ein Zeichen von Erschöpfung darstellen. Dies ist auch in anderen Situationen beschrieben (Sancho et al., 2005).