3. Ergebnisse
3.1.2 Charakterisierung Renin-produzierender Zellen in AS -/- -Mäusen durch
In AS-/--Mäusen treten, wie unter 3.1.1 beschrieben, zusätzlich zu den retrograd rekrutierten Reninzellen der präglomerulären Gefäße weitere Renin-produzierende Zellen auf, die - entgegen der typischen Position - außerhalb der Gefäße lokalisiert sind. Ob diese jedoch direkt von den vaskulären Reninzellen abstammen ist nicht bekannt.
Über den immunhistochemischen Nachweis verschiedener Zellmarker-Proteine sollte überprüft werden, ob perivaskuläre Reninzellen, genau wie retrograd rekrutierte Reninzellen von glatten Gefäßmuskelzellen abstammen oder ob diese vielmehr mit Perizyten-ähnlichen Zellen verwandt sind. Perizyten sind wenig differenzierte Zellen, die der Außenwand von kapillaren Blutgefäßen aufgelagert sind. Zu diesen zählen auch die Zellen des extra- und intraglomerulären Mesangiums, die eine spezialisierte Form der Perizyten darstellen (Kierszenbaum und Tres, 2012, Fawcett, 1998).
Um die Verwandtschaft mit glatten Gefäßmuskelzellen zu überprüfen, wurden die Glattmuskelzell-Marker Glattmuskelaktin und Sm22 verwendet. Als Perizyten-Marker dienten PDGF-Rezeptor-β und das Proteoglycan NG2.
Außerdem wurde das Expressionsmuster von Kollagen I und seiner Vorstufe Prokollagen I untersucht. Experimente zeigten, dass die glatten Muskelzellen der präglomerulären Gefäße, die von Renin-produzierenden Zellen abstammen (Sequeira-Lopez et al., 2004), auch zur Abstammungslinie Kollagen I-produzieren-der Zellen gehören (Florin et al., 2004). Auch für renale Perizyten wurde die Produktion von Kollagen I nachgewiesen (Wiggins et al., 1993; Lin et al., 2008).
Weiterhin wurde das Verteilungsmuster des Gap-Junction-bildenden Proteins Connexin 40 (Cx40) sowie der Aldoketoreduktase 1B7 (AKR1B7) analysiert. Das Auftreten beider Proteine ist in der Wildtyp-Maus eng an die Synthese von Renin gebunden. In allen Renin-produzierenden Zellen der adulten Wildtyp-Niere finden sich sowohl Cx40 als auch AKR1B7 (Kurtz et al., 2009 b; Machura et al., 2012).
Nierenschnitte 10 Wochen alter AS-/--Mäuse wurden mit Antikörpern, die gegen die beschriebenen Proteine gerichtet waren, immunhistochemisch gefärbt und lichtmikroskopisch untersucht. Zum Vergleich wurde das Verteilungsmuster der jeweiligen Proteine in gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen untersucht.
3.1.2.1 Glattmuskelaktin
Glattmuskelaktin ist als Teil des Aktin-Myosin-Komplexes verantwortlich für die Muskelzellkontraktion. Wie der Name bereits sagt, ist das Vorkommen von Glattmuskelaktin charakteristisch für glatte Muskelzellen. In der Niere findet es daher als Marker für alle arteriellen Gefäße Verwendung. In den juxtaglomerulären Zellen der Media der afferenten Arteriole kennzeichnet sein Auftreten den Übergang von Renin-produzierenden Zellen zu glatten Muskelzellen.
a) AS-/-
In den AS-/--Nieren fand sich Glattmuskelaktin in allen glatten Muskelzellen der arteriellen Gefäße. In den afferenten Arteriolen zeigte sich zudem eine große Anzahl intermediärer Zellen, die sowohl Glattmuskelaktin als auch Renin beinhalteten (s. Abb. 3.8 A und B).
In den Reninzellen der perivaskulären Felder war der Glattmuskelaktingehalt dagegen sehr gering. Der Übergang von Gefäß-lokalisierten Reninzellen zu
perivaskulären Reninzellen ließ sich eindeutig an einem Abfall der Glattmuskelaktin-Expression festmachen.
Weiteres Glattmuskelaktin fand sich in sehr geringem Maße im interstitiellen Bereich und im intraglomerulären Mesangium.
b) Wildtyp
In den Wildtypnieren (s. Abb. 3.8 C und D) zeigte sich reichhaltige Glattmuskelaktin-Expression in den glatten Muskelzellen der arteriellen Gefäße.
Nahe des Glomerulus nahm der Gehalt an Glattmuskelaktin im Bereich der Intermediärzellen ab und die glatten Muskelzellen gingen im juxtaglomerulären Bereich in Renin-produzierende Zellen ohne Glattmuskelaktin über.
Zusätzlich zu den Gefäßmuskelzellen fand sich Glattmuskelaktin auch in geringem Maße im interstitiellen Raum sowie in intraglomerulären Mesangialzellen.
Abb. 3.8: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und Glattmuskelaktin (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; Maßstabsbalken: 20 µm;
3.1.2.2 Sm22
Sm22 ist ein Calponin-verwandtes Protein, das spezifisch in glatten Muskelzellen exprimiert wird. Wie Glattmuskelaktin kann es daher in der Niere als Marker für glatte Muskulatur dienen.
a) AS
-/-Sm22 fand sich in der AS-/--Niere genau wie Glattmuskelatin in den arteriellen Gefäßen. In präglomerulären Gefäßzellen wurde die Expression von Sm22 mit dem Auftreten von Renin geringer. Dennoch ließ sich Sm22 auch noch in den Intermediärzellen nachweisen. Nur in wenigen voll ausdifferenzierten Reninzellen fehlte es völlig (s. Abb. 3.9 A und B).
Perivaskuläre Reninzellen zeigten unabhängig vom Maß der Renin-Expression keine Anzeichen für Sm22-Färbung.
Abb. 3.9: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und Sm22 (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; Maßstabsbalken: 20 µm;
b) Wildtyp
Auch in Wildtyp-Mäusen markierte das Auftreten von Sm22 die glatte Muskulatur des arteriellen Gefäßbaums. Im juxtaglomerulären Bereich war es in den Renin-positiven Zellen der afferenten Arteriole nur noch schwach zu erkennen (s. Abb.
3.9 C und D).
3.1.2.3 PDGF-Rezeptor-β
PDGF-Rezeptor-β (PDGFR-β) gehört zur Rezeptor-Familie der Tyrosinkinasen.
Dieser Rezeptor sitzt auf der Oberfläche von Zellen und bindet hier Wachstumsfaktoren aus der PDGF-Familie. Dadurch trägt PDGFR-β zur Regulation wichtiger Vorgänge in der Zelle bei. Dazu zählt die Regulation der Zellproliferation und -differenzierung sowie Wachstum und Migration von Zellen. In der Niere ist PDGFR-β u. a. an der Bildung des kapillaren Netzwerks im Glomerulus beteiligt (Lindahl et al., 1998).
a) AS
-/-Wie Abb. 3.10 (A und B) zeigt, fand sich PDGFR-β-spezifische Fluoreszenz in Nierenschnitten von AS-/--Mäusen im Bereich der Renin-positiven Zellen. Es zeigte sich allerdings ein Unterschied zwischen vaskulären und perivaskulären Reninzellen.
Weder in den glatten Muskelzellen noch in den Renin-produzierenden Zellen der präglomerulären Gefäße (gekennzeichnet durch Pfeile in Abb. 3.10 A und B) fand sich eindeutige PDGFR-β-Expression.
Beim Blick auf die perivaskulären Reninzellfelder wurde jedoch deutlich, dass hier die Renin-produzierenden Zellen auch PDGFR-β exprimierten. Alle sich hier befindenden Renin-positiven Zellen zeigten auch ein Fluoreszenz-Signal für PDGFR-β.
Weiteres PDGFR-β-Signal fand sich im Nierencortex der AS-/--Mäuse in tubulointerstitiellen Zellen sowie im Glomerulus in den intraglomerulären Mesangialzellen.
Abb. 3.10: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und PDGF-Rezeptor-β (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; Pfeile: Vaskuläre Reninzellen; EM: Extraglomeruläres Mesangium; Maßstabsbalken: 20 µm;
b) Wildtyp
In den Renin-produzierenden Zellen der Wildtyp-Niere (s. Abb. 3.10 C und D) ließ sich PDGFR-β, genau wie in den übrigen Gefäßzellen immunhistochemisch nicht eindeutig nachweisen.
Jedoch zeigte sich starke PDGFR-β-Fluoreszenz in direkter Nachbarschaft zu den Renin-bildenden juxtaglomerulären Zellen im Bereich des extraglomerulären Mesangiums.
Weitere PDGFR-β-positive Zellen fanden sich im Interstitium sowie im intraglomerulären Mesangium.
3.1.2.4 NG2
NG2 ist ein membranständiges Proteoglycan, das in der Plasmamembran verschiedener Zelltypen zu finden ist. Durch Interaktion mit verschiedenen Liganden wie Wachstumsfaktoren (Goretzki et al., 1999) und Proteinen (Goretzki et al., 2000; Iida et al., 2001) beeinflusst es hier u. a. Proliferation, Migration und Wachstum der Zellen.
Abb. 3.11: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und NG2 (rot) in AS-/--(A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; eA: efferente Arteriole; G: Glomerulus; EM: Extraglomeruläres Mesangium;
Maßstabsbalken: 20 µm;
a) AS-/-
In der AS-/--Maus war NG2-Färbung in allen Renin-positiven Zellen zu beobachten (s. Abb. 3.11 A und B).
Die NG2-Färbung war allerdings nicht in allen Reninzellen gleich stark. Reninzellen mit starkem NG2-Signal fanden sich insbesondere im Bereich des extraglomerulären Mesangiums zwischen der afferenten und efferenten Arteriole.
eA eA
eA eA
Zusätzlich zu den Renin-positiven Zellen fand sich verstärkte NG2-Fluoreszenz in allen Gefäßmuskelzellen der prä- und postglomerulären Gefäße sowie im Bereich des intraglomerulären Mesangiums.
b) Wildtyp
In der Wildtyp-Niere zeigten sich alle untersuchten Reninzellen auch NG2-positiv (s. Abb. 3.11 C und D).
NG2 fand man außerdem innerhalb der Gefäße, im intraglomerulären Mesangium und am Gefäßpol der Glomeruli im extraglomerulären Mesangium.
3.1.2.5 Kollagen I
Kollagen I ist ein Strukturprotein der extrazellulären Matrix. Experimente zur Verfolgung der Abstammungslinie Kollagen I exprimierender Zellen der Niere (Florin et al., 2004) zeigten einen Zusammenhang mit der Abstammungslinie Renin-produzierender Zellen (Sequeira-Lopez et al., 2004).
a) AS-/-
Weder in den glatten Gefäßmuskelzellen noch in den Renin-produzierenden Zellen der afferenten Arteriole konnte Kollagen I eindeutig nachgewiesen werden.
Kollagen I-Fluoreszenz innerhalb der Gefäße war nicht vom Hintergrund-Signal zu unterscheiden (vaskuläre Reninzellen gekennzeichnet durch Pfeile in Abb. 3.12 A und B)
Jedoch fand sich Kollagen I-Färbung bei der Betrachtung der um die Gefäße liegenden Reninzellfelder. Hier zeigte sich im Extrazellularraum zwischen allen Renin-positiven Zellen starke Kollagen I-Fluoreszenz (s. Abb. 3.12 A und B).
Zusätzlich fand sich Kollagen I-Expression im Nierenkortex der AS-/--Mäuse im gesamten tubulointerstitiellen Raum sowie zu einem geringeren Anteil im Bereich der Mesangialzellen des Glomerulus.
b) Wildtyp
Auch in der Wildtyp-Maus ließ sich Kollagen I in den Renin-produzierenden Zellen der afferenten Arteriole nicht eindeutig nachweisen.
Kollagen I exprimierende Zellen fanden sich zum Großteil im interstitiellen Bereich. Zudem fand sich Kollagen I-Signal im intra- und extraglomerulären Mesangium (s. Abb. 3.12 C und D)
Abb. 3.12: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und Kollagen I (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; EM: Extraglomeruläres Mesangium; Pfeile: Vaskuläre Reninzellen;
Maßstabsbalken: 20 µm;
3.1.2.6 Prokollagen I
Neben Kollagen I wurde auch das Vorkommen von Prokollagen I im Nierenkortex der AS-/--Mäuse untersucht. Prokollagen I stellt die unreife Vorläuferform der Kollagen I-Moleküle dar. Die reife Form des Peptids entsteht durch Abspaltung eines kurzen N-terminalen Bereichs von Prokollagen I. Ein Antikörper, der an diesen N-terminalen Teil bindet, erlaubte den Nachweis der unreifen Prokollagen I-Peptide (Kaarteenaho-Wiik et al., 2007).
a) AS-/-
Prokollagen I-positive Zellen zeigten sich im Kortex der Nieren von AS-/--Mäusen ausschließlich im Bereich der Renin-produzierenden Zellen (s. Abb. 3.13 A und B).
In keinen anderen Nierenzellen konnte Prokollagen I nachgewiesen werden.
Genauere Betrachtung der Renin-bildenden Zellen zeigte, das Prokollagen I nicht mit allen Reninzellen kolokalisierte.
Reninzellen in der Wand der präglomerulären Gefäße waren stets frei von Prokollagen-Expression (exemplarische Zellen gekennzeichnet durch Pfeile in Abb. 3.13 A und B). Weder die juxtaglomerulären Reninzellen noch weiter distal liegende Reninzellen der afferenten Arteriole und der Interlobular-Arterie zeigten Anzeichen für das Vorhandensein von Prokollagen I.
Sobald man jedoch Reninzellen außerhalb der Gefäßwand in den perivaskulären Feldern betrachtete, zeigten diese eine klare Kolokalisation mit Prokollagen I. Hier wurde jedoch auch deutlich, dass das Prokollagen I-Signal nicht in allen perivaskulären Zellen gleich stark vorhanden war. In Zellen, die eine starke Renin-Färbung aufwiesen, ließ sich Prokollagen I nur schwer nachweisen (exemplarische Zellen gekennzeichnet durch leere Pfeilspitzen in Abb. 3.13 A und B). Dagegen fand sich eine umso stärkere Prokollagen I- Färbung in Zellen mit schwachem Renin-Signal.
b) Wildtyp
In den zum Vergleich untersuchten Nierenschnitten von Wildtyp-Mäusen fand sich Prokollagen I einzig in wenigen Zellen im Bereich des extraglomerulären Mesangiums, lokalisiert zwischen Macula densa-Region und juxtaglomerulären Zellen (gekennzeichnet durch Pfeilspitze in Abb. 3.13 C und D).
Unter den übrigen Nierenzellen fanden sich keine weiteren Prokollagen I-positiven Zellen.
Abb. 3.13: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und Prokollagen I (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; Pfeile: Vaskuläre Reninzellen; leere Pfeile: Renin-positive Zellen mit schwacher Prokollagen I-Produktion; Pfeilspitze: Prokollagen I-Färbung im extraglomerulären Mesangium; Maßstabsbalken: 20 µm;
3.1.2.7 Connexin 40
Connexin 40 ist ein Gap-Junction bildendes Protein, welches die juxtaglomerulären Zellen untereinander, mit dem Endothel der Blutgefäße und mit dem benachbarten extraglomerulären Mesangium verbindet. Studien zeigten, dass die Expression von Cx40 eng mit der Synthese von Renin verbunden ist (Kurtz et al., 2009 b).
a) AS
-/-Die vaskulär lokalisierten Reninzellen inklusive der juxtaglomerulären Zellen wiesen allesamt eine starke Cx40-Färbung auf (s. Abb. 3.14 A und B).
Auch in den perivaskulären Zellfeldern zeigten alle Reninzellen eine starke Produktion von Cx40. Die Stärke der Cx40 Expression war dabei jeweils unabhängig von der Stärke der Renin-Expression. Sobald sich in einer Zelle Renin nachweisen ließ, fand sich eine konstant starke Cx40-Färbung.
Neben den Renin-produzierenden Zellen zeigte sich Cx40 auch im Endothel der Blutgefäße sowie innerhalb des Glomerulus in den intraglomerulären Mesangialzellen.
b) Wildtyp
Im Wildtyp zeigten die juxtaglomerulären Reninzellen reichhaltige Cx40-Produktion (s. Abb. 3.14 C und D).
Auch in den, an die Reninzellen angrenzenden, extraglomerulären Mesangialzellen war eine starke Cx40-Färbung festzustellen.
Weiterhin ließ sich Cx40-Protein im Endothel der Blutgefäße sowie im intraglomerulären Mesangium nachweisen.
Abb. 3.14: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und Connexin 40 (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; EM: Extraglomeruläres Mesangium; Maßstabsbalken:
20 µm;
3.1.2.8 Aldoketoreduktase 1B7
Genexpressions-Analysen an isolierten Reninzellen zeigten, dass diese im Vergleich zu den übrigen Nierenzellen Aldoketoreduktase 1B7 verstärkt exprimierten. In weiteren Analysen, in denen ein AKR1B7-spezifischer Antikörper zur Färbung von Wildtyp-Nierenschnitten verwendet wurde, konnte diese Aussage immunhistochemisch belegt werden. Stimulierung des RAAS bewirkte zudem, dass glatte Muskelzellen im Zuge der Transformation zu Renin-bildenden Zellen vermehrt AKR1B7 produzierten (Brunskill et al., 2011; Machura et al., 2012).
Abb. 3.15: Immunfluoreszenzfärbung für Renin (grün) und AKR1B7 (rot) in AS-/-- (A und B) und Wildtyp-Mäusen (C und D). aA: Afferente Arteriole; G: Glomerulus; Maßstabsbalken: 20 µm;
a) AS
-/-AKR1B7 fand sich in allen vaskulären Reninzellen - egal ob es sich um juxtaglomeruläre oder weiter distal liegende Zellen handelte.
Im Bereich der perivaskulären Reninzellfelder ließ sich dagegen kein AKR1B7-Signal nachweisen (s. Abb. 3.15 A und B).
b) Wildtyp
Im Wildtyp fand sich in allen Renin-produzierenden juxtaglomerulären Zellen AKR1B7-Fluoreszenz (s. Abb. 3.15 C und D).
Auch die angrenzenden Intermediärzellen in der Media der afferenten Arteriole zeigten sich AKR1B7-positiv.
In den übrigen Wildtyp-Nierenzellen ließ sich kein weiteres AKR1B7 nachweisen.
3.1.2.9 Zusammenfassung
Die Untersuchung verschiedener Zellmarker-Proteine zeigte, dass Unterschiede im Genexpressionsmuster zwischen vaskulären und perivaskulären Reninzellen von AS-/--Mäusen bestehen (s. Tab. 1).
So finden sich im Bereich der perivaskulären Reninzellen weder die Glattmuskelzellmarker Glattmuskelaktin und Sm22 noch Aldoketoreduktase 1B7 - sattdessen produzieren diese Zellen im Vergleich zu den Gefäß-lokalisierten Reninzellen vermehrt Kollagen I und Prokollagen I sowie PDGF-Rezeptor-β. Genau wie die vaskulären Reninzellen sind auch die Reninzellen der perivaskulären Felder über Cx40-haltige Gap-Junctions miteinander verbunden.
Vaskuläre Reninzellen Perivaskuläre Reninzellen
Glattmuskelaktin ± -
Sm22 ± -
PDGF-Rezeptor-β ± +
NG2 ± ±
Kollagen I - +
Prokollagen I - +
Connexin 40 + +
AKR1B7 + -
+ starke Expression; ± schwache Expression; - keine Expression;
Tab. 1: Expression von Zellmarker-Proteinen in vaskulären und perivaskulären Reninzellen der AS-/--Maus.