Charakterisierung EMA/E2F-6-defizienter Mäuse

EMA/E2F-6^+/─- und EMA/E2F-6^−/−-Mäuse beider Stammhintergründe wurden – mit einer Einschränkung – der Mendelschen Vererbungsregel folgend geboren (Tabelle 4). In der F2-Generation des C57BL/6x129/Ola-Stammes waren die heterozygoten und die homozygoten Mäuse jeweils um die Hälfte reduziert. In den folgen-den Generationen dagegen traten die Nachkommen mit dem erwarteten Verhältnis auf. Es fehlten in der F2 -Generation sowohl Weibchen als auch Männchen zu gleichen Teilen (Daten nicht gezeigt). Um der Ursache des Verlustes der Mäuse nachzugehen, wurden die heterozygoten Mäuse der F1-Generation (die direkten Nachkom-men der Chimären) beider Geschlechts mit einem C57BL/6-Wildtyppartner verpaart. Allerdings wurden gleich viele heterozygote und Wildtyp-Mäuse geboren, wie es für den Fall, dass EMA/E2F-6 keine limitierende Funk-tion in der Embryonalentwicklung hat, zu erwarten war (Daten nicht gezeigt). Die Frage nach der Ursache der Reduktion wurde dann nicht weiter verfolgt.

Junge EMA/E2F-6^+/─- und EMA/E2F-6^−/−-Mäuse waren ohne offensichtliche Beeinträchtigungen. Das Gewicht der inneren Organe in Relation zum Körpergewicht war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nicht verän-dert. Die inneren Organe wurden in Kooperation mit Herrn Prof. Krenn (Institut für Pathologie der Charité) histologisch untersucht. Es wurden keine Fehlentwicklungen festgestellt (Daten nicht gezeigt). Die Mäuse waren fruchtbar und im Gegensatz zu einer veröffentlichten Studie waren die Hoden und Nebenhoden unserer EMA/E2F-6^−/−-Mäuse ebenfalls unverändert (Storre, et al., 2002). Die Autoren haben eine verminderte Anzahl reifer Spermatozyten und vermehrt Leydig-Zellen im Hoden sowie einen unvollständigen Füllzustand des Nebenhodens mit Spermatozyten beschrieben. Aufgrund dieser Studie wurden zusätzlich die Hoden und

Neben-hoden von je fünf Wildtyp- und EMA/E2F-6^−/−-Männchen untersucht, die exakt das Alter der Tiere wie in der Veröffentlichung hatten. Das Ergebnis bestätigte unsere erste Untersuchung (Daten nicht gezeigt). Mögliche Ursachen für die Unterschiede zwischen beiden Analysen werden später diskutiert.

Tabelle 4: Nachkommen aus den Verpaarungen heterozygoter Mäuse.

WT EMA^+/─ EMA^−/− P^a

Erwartetes Verhältnis 1 2 1 Stamm C57BL/5x129/Ola:

Gesamtpopulation Anzahl Nachkommen 107 183 108 0,512 Beobachtetes Verhältnis 1,0 1,7 1,0

F2-Generation Anzahl Nachkommen 56 56 36 0,02 Beobachtetes Verhältnis 1,0 1,0 0,7

F3-Generation und folgende Anzahl Nachkommen 51 127 72 0,434 Beobachtetes Verhältnis 1,0 2,5 1,4 Stamm 129/Ola:

Gesamtpopulation Anzahl Nachkommen 69 130 48 0,3 Beobachtetes Verhältnis 1,0 1,9 0,7

a: Signifikanzschranke nach Chi-Quadrattest

Neben der Bewertung der augenscheinlichen Fitness und der Untersuchung der Organe liefert auch das Körpergewicht eine Einschätzung über den allgemeinen Gesundheitszustand und die postnatale Entwicklung.

Das Gewicht der Mäuse wurde während der ersten 30 Lebenswochen im zweiwöchigen Rhythmus bestimmt.

Die Abbildung 11 zeigt, dass Wildtyp-, EMA/E2F-6^+/─- und EMA/E2F-6^−/−-Mäuse mit einem Lebensalter von zwei Wochen gleich schwer waren und in gleichem Maß an Gewicht zunahmen. Auch bei sporadischen Mes-sungen zu späteren als den abgebildeten Zeitpunkten unterschieden sich die Mäusegruppen nicht voneinander (Daten nicht gezeigt).

Die Abbildung 12 stellt dar, dass EMA/E2F-6^−/−-Mäuse ebenso lange wie ihre Wildtyp-Geschwister lebten.

Mäuse, die anhand der Richtlinien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations körper-lich litten, wurden getötet und zusammen mit den gestorbenen Mäusen auf die Krankheits- bzw. Todesursache untersucht. Es wurde eine Reihe von makroskopischen Veränderungen wie beispielsweise fehlende Schneide-zähne, Eierstockzysten, Splenomegalie und Tumore in der Speicheldrüse und in der Lunge mit gleicher Häufig-keit und bei gleichem Alter der EMA/E2F-6^−/−-und Kontroll-Mäuse festgestellt (Daten nicht gezeigt). Leber-tumore, Tumore im Afterbereich und in der Niere sowie eine vergrößerte Bläschendrüse, die einen ödematösen Tumor darstellt, waren in EMA/E2F-6-defizienten Mäusen dagegen seltener zu finden. Bei EMA/E2F-6^−/− -Mäu-sen traten zudem die Nierentumore später als bei Wildtyp-Mäu-Mäu-sen auf (Daten nicht gezeigt). Diese Befunde können Hinweise dafür sein, dass das Fehlen von EMA/E2F-6 eine Hemmung unkontrollierten Gewebewachs-tums zur Folge hat. Daher wurden diese Tumore einer histopathologischen Analyse unterzogen (mit Kontrolle durch Herrn Prof. Krenn): 42 % der Tumore aus Wildtyp-Mäusen und 27 % der Tumore aus EMA/E2F-6-defizienten Mäuse waren maligne (Tabelle 5). Da der Unterschied statistisch nicht signifikant ist (Log Rank

Test: P=0,8), deuten die Daten an, dass der Verlust von EMA/E2F-6 keine Einfluss auf die Entwicklung von

Abb. 11: Das Körpergewicht EMA/E2F-6-mutierter Mäuse ist gleich dem der Kontrollgruppe. Von je zehn Wildtyp-, EMA/E2F-6^+/─ und EMA/E2F-6^−/−-Mäusen (A) mit einem gemischten C57BL/6x129Ola- und (B) einem reinen 129/Ola-Stammhintergrund wurde das Körpergewicht innerhalb der ersten 30 Lebenswochen bestimmt.

E2F-1, E2F-3 und E2F-4 regulieren die Differenzierung der Adipozyten (Fajas, et al., 2002). Unter fettrei-chem Futter nehmen Wildtyp-Mäuse innerhalb kurzer Zeit an Gewicht zu; E2F-1^−/−-Mäuse dagegen nicht, da sie nur unterentwickelte Fettzellen besitzen. Ob EMA/E2F-6 auch an der Differenzierung von Adipozyten beteiligt ist, wurde analysiert, indem die Fähigkeit der EMA/E2F-6^−/−-Mäuse zur Fettspeicherung untersucht wurde. Da Mäuse in der Käfighaltung nach dem Abschluss der Wachstumsphase Fettpolster anlegen, gab die Bestimmung des Körpergewichts bereits einen ersten Hinweis auf einen normalen Fetthaushalt und Energiestoffwechsel von EMA/E2F-6^−/−-Mäusen. Mäuse beider Geschlechts wurden mehrere Wochen unter einer fettreichen Diät gehal-ten. Obwohl Wildtyp- und EMA/E2F-6-defiziente Mäuse mit fettreichem Futter deutlich an Gewicht zunahmen, wie der Vergleich mit einer Kontrollgruppe unter Haltungsfutter zeigte, unterschied sich das Ausmaß der Zu-nahme beider Tiergruppen nicht (Daten nicht gezeigt). Da sich auch das weiße und braune Fettgewebe EMA/E2F-6-defizienter Mäuse bei einer histologischen Analyse nicht von Kontrollgewebe unterschieden hatte (Daten nicht gezeigt), konnte zusammenfassend kein Hinweis auf eine Beteiligung von EMA/E2F-6 an der Adipozytendifferenzierung gefunden werden.

Weibchen

0 20 40 60 80 100

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Alter (Monate)

WT, n=23 EMA-/-, n=20

Männchen

0 20 40 60 80 100

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Alter (Monate)

WT, n=17 EMA-/-, n=22

Abb. 12: Die Lebenserwartung EMA/E2F-6-defizienter Mäuse ist unverändert. Die gewerteten Tiere sind entweder auf natürlichem Wege gestorben oder mussten aufgrund ihres schlechten Gesundheitszustandes getötet werden.