Charakterisierung des Prion-Spezies-Gemisches

Es wurde eine hPrP90-230+His-Probe aus dem Produktionslauf im Kreislauf bei einer Fließgeschwindigkeit von 5,0 mL/min (11,1 mW bei 285 nm) und drei verschiedene Proben aus

den Produktionsläufen im Durchfluss bei einer Flussrate von 0,5 mL/min (21,5 mW bei 285 nm sowie 20,0 mW und 4,6 mW bei 243 nm) mittels DLS-Messung untersucht. Die Probe des Produktionslaufes im Kreislauf sowie die Probe im Durchfluss, die bei einer Wellenlänge von 243 nm mit einer Laserleistung von 4,6 mW bestrahlt wurde, enthielt nur das „dimere“

Intermediat neben dem monomeren PrP, wohingegen die bei einer Wellenlänge von 285 nm mit 21,5 mW bestrahlte Probe zusätzlich den „trimeren“ Zwischenzustand und die bei einer Wellenlänge von 243 nm mit 20 mW bestrahlte Probe sogar auch noch spezifische oligomere Spezies beinhaltete (Abbildung 34).

Abbildung 34: DLS-Charakterisierung von UV-bestrahltem hPrP90-230+His im Vergleich zum monomeren hPrP90-230+His mit der jeweiligen Radienverteilung (A), dem dazugehörigen Histogramm (B) und der jeweiligen SDS-PAGE-Analyse der entsprechenden Probe. Vom a) monomeren PrP (1) über b) dem Gemisch (Durchflusssystem 4,6 mW bei 243 nm) aus monomeren PrP und „dimeren“ Intermediat (2), c) der Probe (Durchflusssystem 21,5 mW bei 285 nm) mit zusätzlichem „trimeren“ Zwischenzustand (3) bis hin zur d) Probe (Durchflusssystem 20 mW bei 243 nm) mit der spezifischen oligomeren Spezies (4) wurden heterogener, dadurch war eine kontinuierliche Zunahme des dominierenden Radius erkennbar. Das Gemisch e) aus monomerem PrP und „dimerem“ Intermediat des Produktionslaufes im Kreislauf (11,1 mW bei 285 nm) war jedoch monodispers im Gegensatz zu den anderen vier Proteinproben.

Sowohl die unbestrahlte Probe mit dem monomeren hPrP90-230+His als auch das Gemisch aus PrP-Monomer und „dimerem“ Intermediat (Durchflusssystem 4,6 mW bei 243 nm) weisen einen dominierenden Radius bei 3,4 und 3,0 nm auf, was in etwa dem hydrodynamischen Radius eines Tetramers (3,3 nm) und Trimers (3,0 nm) entsprechen würde. Eigentlich wäre bei dem PrP-Monomer ein hydrodynamischer Radius von 2,1 nm und bei dem „PrP-Dimer“ von 2,6 nm zu erwarten, zumindest beim „PrP-Dimer“ liegt der erwartete RH-Wert im Bereich des relativen Fehlers des gemessenen hydrodynamischen Radius. Bei der Probe mit dem zusätzlichem „trimeren“ Zwischenzustand (Durchflusssystem 21,5 mW bei 285 nm) und dem Gemisch aus monomerem PrP und „dimerem“ Intermediat des Produktionslaufes im Kreislauf (11,1 mW bei 285 nm) wären RH-Werte von 3,0 nm (Trimer) und 2,6 nm (Dimer) zu erwarten gewesen. Der dominierende hydrodynamische Radius lag jedoch im Bereich 19,5 bzw.

21,2 nm. Diese Radien liegen etwas über dem des spezifischen Oligomers (17 ± 2 nm). Die SDS-PAGE-Analyse zeigt jedoch, dass die Anwesenheit des spezifischen Oligomers ausgeschlossen werden kann. Diese Ergebnisse lassen ebenfalls das Postulat zu, dass es sich bei den unter denaturierenden Bedingungen dem apparenten Molekulargewicht nach „dimeren“

bzw. „trimeren“ Intermediaten im nativen Zustand um eine diffuse Vorstufe der spezifischen Oligomere handeln könnte. In dem Gemisch mit der spezifischen oligomeren Spezies neben dem PrP-Monomer sowie den „dimeren“ und „trimeren“ Zwischenzuständen (Durchflusssystem 20 mW bei 243 nm) war der dominierende hydrodynamische Radius mit 39,5 nm sehr viel größer als der des spezifischen Oligomers (17 ± 2 nm), was ebenfalls für die postulierte diffuse oligomere Vorstufe spricht.

Aufgrund der Ergebnisse der DLS-Messungen und der nativen PAGE in Kombination mit der SDS-PAGE-Analyse scheint es, dass in den Proben unterschiedliche Vorstufen des stabilen, spezifischen Oligomers vorhanden sind. Diese sind jedoch noch sehr diffus und instabil, wodurch zum einen die höheren hydrodynamischen Radien, zum anderen aber auch die Anzahl der Banden im nativen Gel und die unterschiedlichen Banden unter denaturierenden SDS-PAGE-Bedingungen, die dem apparenten Molekulargewicht eines „dimeren“, „trimeren“ und

„tetrameren“ Intermediates entsprechen, erklärt werden können.

Da sich das CD-Signal additiv aus allen Anteilen der Einzelproben zusammensetzt, können geringe Konzentrationen an β-Faltblatt-Strukturen in Abweichungen resultieren, wenn die Konzentration ausreichend hoch ist. Daher wurde die Sekundärstruktur der Intermediat-Mischungen mittels CD-Spektroskopie untersucht (Abbildung 35).

Abbildung 35: CD-Spektren des monomeren unbestrahlten hPrP90-230+His sowie der UV-bestrahlten PrP-Proben mit unterschiedlichem Anteil an Intermediaten. Der Nulldurchgang sowie die Minima und Maxima der Kurven sind annähernd gleich und weisen den charakteristischen α-helikalen Verlauf auf.

Die CD-Spektren aller Proben wiesen den gleichen Nulldurchgang sowie identische Minima und das Maxima auf, welche charakteristisch für eine dominierende α-helikale Faltung sind.

Entweder war die Konzentration der Intermediate im Verhältnis zum monomeren PrP für die CD-Messungen zu gering oder aber die Intermediate weisen noch keine β-Faltblatt-reiche Struktur auf.

Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass die Vorstufen der Oligomere in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdauer unter denaturierenden Bedingungen in dimere, trimere und tetramere Bausteine zerfallen. Das impliziert entweder sehr starke nicht-kovalente Wechselwirkungen innerhalb dieser Bausteine, die durch denaturierende SDS-PAGE-Bedingungen nicht aufgehoben werden können, oder sogar kovalente Modifikationen. Um das zu untersuchen, wurden die bestrahlten Proben massenspektrometrisch untersucht. Bei der UV-Bestrahlung werden in erster Linie die Aminosäuren Methionin und Histidin oxidiert, wodurch Methioninsulfoxid und 2-Oxo-Histidin entsteht. Diese oxidative Modifikation kann zur Umwandlung und Aggregation des PrP durch Störung der strukturellen Integrität führen (Redecke et al., 2009). Da die Oxidation der Methionin-Reste auch während der proteolytischen Spaltung mit Trypsin durch die Anwesenheit von Sauerstoff erfolgen konnte, wurde monomeres, unbestrahltes PrP als Kontrolle ebenfalls für die massenspektrometrische Untersuchung präpariert.

Nach erfolgter SDS-PAGE des UV-bestrahlten hPrP90-230 wurden die Proteinbanden, die dem apparenten Molekulargewicht des monomeren bzw. „dimeren“ PrP entsprachen, aus dem Gel geschnitten und nach dem Protokoll für die proteolytische Spaltung im Gel mit Trypsin inkubiert. Die entstandenen Peptidfragmente wurden für die MS-Analyse aus dem Gel

-400 -200 0 200 400 600

190 200 210 220 230 240 250 260

θ[deg cm2 dmol-1 ]

λ [nm]

unbestrahltes hPrP90-230 MonoDimer Einzelbestr.

MonoDiTrimer Einzelbestr.

MonoDiTriOligo Einzelbestr.

MonoDi Kreislauf

extrahiert. Während dieses Verfahrens wurden die Disulfidbrücken der Cystein-Reste reduziert und, um eine Reoxidation zu verhindern, anschließend carbamidomethyliert. Diese Modifikation der Cystein-Reste sowie die mögliche Oxidation der Methionin- und Histidin-Reste haben eine Verschiebung der Massen zur Folge, welche bei der Massenkalkulation für die Peptidfragmente, die diese Aminosäurereste enthielten, berücksichtigt werden musste. Die Vorhersage der theoretisch möglichen Peptide erfolgte mit Hilfe des Programmes PeptideMass des ExPASy Proteomics Servers (ExPASy, 2013). Die MS-Analyse wurde im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Schlüter mit einem ESI-Massenspektrometer (LC/MSD Trap XCT Ultra von Agilent) am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf durchgeführt. Dabei wurden die folgenden Peptide (Tabelle 7) detektiert.

Tabelle 7: Theoretisch berechnete sowie gemessene Masse der Peptidfragmente der durch Trypsin-Spaltung der SDS-PAGE-Banden erzeugten monomeren hPrP90-230+His sowie „dimeren“ Intermediate nach der MS-Analyse (Ox. = Oxidation, Ca. = Carbamidomethylierung)

Fragment Sequenz berechnete Masse

Gemessene Masse monomeres

hPrP90-230

„dimeres“

hPrP90-230

149-156 YYRENMHR 1 167,5

1 183,5 (Ox.)

1 167,5

1 184,6 -

152-156 ENMHR 685,3 685,5 685,4

186-194 QHTVTTTTK 1 015,5 1 015,3 1 015,4

195-204 GENFTETDVK 1 138,5 1 138,2 1 138,2

195-208 GENFTETDVKMMER 1 717,7 (Ox. 2x) 1 717,3 1 717,2

209-220 VVEQMCITQYER

1 497,7 1 513,7 (Ox.) 1 554,7 (Ca.) 1 570,7 (Ox. + Ca.)

1 496,5 1 513,3 1 554,3 1 570,3

1 496,6 - 1 554,2 1 570,3

221-228 ESQAYYQR 1 043,5 1 043,2 1 043,2

Die ausgeschnittenen Proteinbanden konnten anhand der identifizierten Peptide und mit Hilfe der MASCOT-Datenbank (Matrix Science) erfolgreich als hPrP-Fragmente identifiziert werden.

Allerdings wurden keine kovalenten Modifikationen detektiert, die spezifisch dem „dimeren“

Intermediat zuzuordnen sind. Währenddessen etwa 36 % der Sequenz des hPrP90-230-Monomers durch die identifizierten Fragmente abgedeckt werden konnte, waren es beim „PrP-Dimer“ etwa 30 %. Einige Peptidfragmente konnten nicht detektiert werden, darunter sowohl die sehr kleinen Fragmente AS 107-110 sowie AS 229-230 als auch die sehr großen Fragmente AS 90-106 und AS 111-148, welche wahrscheinlich nicht ausreichend aus dem Gel extrahiert wurden. Mit Ausnahme eines Peptids, das beim „dimeren“ Intermediat nicht identifiziert wurde (AS 149-156), konnten durch die MS-Messungen keine Unterschiede im Fragmentmuster

zwischen dem PrP-Monomer und dem „PrP-Dimer“ festgestellt werden. Die Oxidationen waren wahrscheinlich aufgrund der Anwesenheit von Sauerstoff während der proteolytischen Spaltung in beiden Proben identisch.

Mit dem monomeren mPrP und der oligomeren Spezies wurden ebenfalls entsprechende MS-Analysen mit vorangegangener Trypsin-Spaltung im SDS-Gel durchgeführt. Die Sequenzabdeckung des mPrP89-231-Monomers durch die identifizierten Fragmente lag bei nur etwa 25 % und beim PrP-Oligomer sogar nur bei etwa 19 %. Auch hier ließen die Resultate keine Rückschlüsse auf UV-induzierte kovalente Modifikationen der Aminosäuren in der oligomeren Spezies zu (Tabelle 8).

Tabelle 8: Theoretisch berechnete sowie gemessene Masse der Peptidfragmente der durch Trypsin-Spaltung der SDS-PAGE-Banden erzeugten monomeren mPrP89-230 sowie spezifischen Oligomere nach der MS-Analyse (Ox. = Oxidation, Ca. = Carbamidomethylierung)

Fragment Sequenz berechnete Masse

Gemessene Masse monomeres

mPrP89-231

oligomeres mPrP89-231

148-150 YYR 501,2 501,4 501,2

148-155 YYRENMYR 1 194,5 1 194,8 -

151-155 ENMYR 712,3 712,3 -

204-207 MMER 566,2 566,4 -

208-219 VVEQMCVTQYQK

1 455,7 1 471,7 (Ox.) 1 512,7 (Ca.)

1 455,7 1 471,8

-

1 456,2 1 472,2 1 512,3

220-231 ESQAYYDGRRSS 1 418,6 1 418,7 1 418,1