4.1 Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des
-Rezeptor-Agonisten CGS-21680 ist an der A2B(EL2-A2A)-Rezeptormutanten um den Faktor 124 höher als bei dem A2B-Rezeptor. Auch dieses Ergebnis ist bedeutend, da dieser Ligand weder an den A2B-Rezeptor-Wildtyp bindet, noch diesen aktiviert. Somit interagiert CGS-21680 offensichtlich mit der zweiten extrazellulären Schleife des A2A-Rezeptors und dies führt zu einer Erhöhung der Affinität. Bei M2-Acetylcholin-Rezeptoren ist bekannt, dass über Bereiche nahe der allosterische Bindungsstelle die Rezeptorbewegung und die Kopplung der G-Proteine reguliert werden kann.278 Eventuell ist auch bei den Adenosin-Rezeptoren durch diese Konformationsänderung und die Kontrolle der G-Proteine möglich. Die Bereiche könnten hier beispielsweise in der zweiten extrazellulären Schleife liegen, da diese besonders groß und flexibel ist.
Möglicherweise bindet aber auch ein Ligand mit einem großen voluminösen Rest besser, da dieser aus der Bindungstasche herausragt und durch die Schleife des A2A -Rezeptors stabilisiert wird. Die Bindung ist vermutlich im A2A-Rezeptor auch wichtig, aber sicherlich nicht alleine für die starke Bindung zwischen CGS-21680 und dem A2A -Rezeptor verantwortlich, da die Affinität von CGS-21680 an den A2A-Rezeptor wesentlich höher ist als zur A2B(EL2-A2A)-Mutante. Damit sind weitere Aminosäuren aus anderen Teilen des Rezeptors wichtig für diese Bindung. Alle Ergebnisse mit [³H]PSB-603 können nur in Bezug auf die Antagonist-Bindungsstelle und nicht auf die Agonist-Bindungsstelle diskutiert werden, da bislang noch kein Experiment mit einem radioaktiv markierten A2B-Agonisten etabliert ist. Die Glykosylierung kann ebenfalls einen Einfluss auf die Bindung haben. Allerdings spielt dieser Effekt, wenn überhaupt, beim A2B-Rezeptor nur eine untergeordnete Rolle, da bereits in der eigenen Diplomarbeit die A2B-Rezeptormutante S165A generiert und untersucht wurde, bei der eine der beiden Glykosylierungsstellen des A2B-Rezeptors eliminiert ist. Dennoch zeigte diese Rezeptormutante keine Änderung der Bindung oder der Funktionalität des Rezeptors. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die zweite extrazelluläre Schleife für die hA2A- und hA2B-Rezeptorsubtypenselektivität wichtig ist, da der EL2 sowohl einen Einfluss auf die Bindung des A2B-spezifischen Liganden BAY60-6583 als auch des A2A-spezifischen Agonisten CGS-21680 hat. Allerdings ist damit die Affinitätsdifferenz zwischen diesen Subtypen nicht vollkommen erklärbar. Es gibt sicherlich noch weitere Faktoren oder Aminosäuren außerhalb dieser Schleife, die zur Affinitätsdifferenz beitragen. Die Ergebnisse am A2A-Rezeptor zeigen deutlich, dass alle Bindungsstudien mit [³H]PSB-603 keine genügende spezifische Bindung zum A2A
-spezifisch binden. Interessant wäre nun eine Rezeptormutante, bei der im A2A-Rezeptor die zweite extrazelluläre Schleife gegen die des A2B-Rezeptors ausgetauscht wird, also die Rezeptormutante hA2A(EL2-A2B). Theoretisch müsste hier ein deutlicher Verlust der Bindungsstärke von CGS-21680 verglichen mit dem Wildtyp-A2A-Rezeptor zu messen sein. BAY60-6583 dürfte keine Bindung zu dieser Mutante zeigen. Interessant dürfte dann besonders das Ergebnis von MSX-2, PSB-603 und NECA sein, wobei hier eine Prognose schwierig ist. Bei diesen Experimenten kann sowohl die Agonist- als auch die Antagonist-Bindungsstelle des A2A-Rezeptors noch genauer untersucht werden. Die Ergebnisse können zur Entwicklung selektiver Wirkstoffe beitragen und darüber hinaus Erkenntnisse zur Rolle des EL2 liefern.
4.1.3 Funktionelle Experimente: cAMP-Akkumulation
Die Agonisten Adenosin, NECA und BAY60-6583 zeigen keinen oder nur einen geringen Einfluss auf die EC50-Werte bei der hA2B(EL2-A2A)-Rezeptormutante verglichen mit dem A2B-Wildtyp. Hierbei scheint die zweite extrazelluläre Schleife in Bezug auf die Potenz der Verbindung zunächst nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Allerdings ist auffallend, dass bei der Rezeptormutante hA2B(EL2-A2A) im Gegensatz zu den Wildtypen hA2B und hA2A hochsignifikante Differenzen bei der intrinsischen Aktivität (Maximaleffekt, Efficacy) nach Stimulierung mit unterschiedlichen Agonisten beobachtet wird. Die Efficacy ist sowohl bei dem endogenen Agonisten Adenosin und dem unselektiven, nukleosidischen Agonisten NECA, als auch bei dem selektiven, nicht-nukleosidischen Agonisten BAY60-6385 und dem selektiven, nukleosidischen Agonisten CGS-21680 in der Loop-Mutante signifikant erhöht im Vergleich zum A2B-Wildtyp-Rezeptor. Da sich die EC50-Werte (wie oben beschrieben) bei den funktionellen Experimenten bei NECA, Adenosin und BAY-606583 bei Rezeptormutante und Wildtyp nicht signifikant unterscheiden, scheint die veränderte Rezeptorkonformation sich hauptsächlich auf den Aktivierungsmechanismus auszuwirken. Durch die ausgetauschte Schleife verändert worden. Diese Veränderung führt offensichtlich zu einer höheren Efficacy nach Stimulation mit einem Agonisten. Möglicherweise ist mit dem Austausch der zweiten extrazellulären Schleife die verknüpfte fünfte Transmembrandomäne (TM5) und die daran hängende dritte intrazelluläre Schleife (IL3) so in der Konformation verändert, dass die Aktivierung des G-Proteins durch den IL3 nach Stimulation mit einem Agonisten wesentlich erleichtert ist. Die zweite extrazelluläre Schleife des hA2A
-Rezeptors spielt eine Rolle bei der Aktivierbarkeit ganz bestimmter Agonisten, wie dem spezifischen A2A-Rezeptor-Agonisten CGS-21680. Dieser Agonist aktiviert nun die A2B-Rezeptor-Mutante mit der zweiten extrazellulären Schleife des A2A-Rezeptors. Die Rezeptormutante ist im Gegensatz zum A2B-Rezeptor leicht aktivierbar, jedoch unterscheidet sich der EC50-Wert noch deutlich von dem des A2A-Rezeptors, zu dem die Verbindung viel affiner ist. Damit ist die zweite extrazelluläre Schleife des A2A -Rezeptors nicht nur wichtig bei der Bindung des Liganden CGS-21680, sondern auch für die Aktivierbarkeit und Efficacy des Rezeptors.
Bei den cAMP-Akkumulationsexperimenten mit A2B-Wildtyp-Rezeptoren mit NECA in Kombination mit CGS-21680 in verschiedenen Konzentrationen, zeigt sich kein deutlicher Unterschied, der auf die Modulation von A2B-Rezeptoren durch CGS-21680 schließen lässt. Es besteht zwar ein signifikanter Unterschied bei der cAMP-Akkumulation zwischen 10 µM und 100 µM CGS-21680 in Kombination mit 0,1 µM NECA, allerdings besteht diese Differenz auch in der Abwesenheit von NECA. Hierbei ist kein besonderer Einfluss von CGS-21680 auf den A2B-Rezeptor festzustellen. Wird unter gleichen Bedingungen das Experiment mit 1 µM NECA durchgeführt, dann ergibt sich eine signifikante Steigerung der cAMP-Akkumulation. Möglicherweise überführen hohe Konzentrationen von CGS-21680 den A2B-Rezptor von der inaktiven Form in die aktive Form und bewirkt dadurch eine höhere cAMP-Ausschüttung nach Agonistzugabe. Allerdings spielt dieser Effekt nur eine untergeordnete Rolle.
4.1.4 Computermodell der hA2B(EL2-hA2A)-Rezeptor-Mutante
Die Computermodelle der hA2B- und hA2A-Rezeptoren, sowie der hA2B(EL2-hA2A )-Rezeptormutante zeigen alle jeweils eine unterschiedliche Konformation der zweiten extrazellulären Schleife. Da genau dieser Bereich besonders flexibel ist, könnte der EL2 des A2A-Rezeptors auch im A2B-Rezeptor eine andere Konformation einnehmen als im Wildtyp. In dem Modell der Rezeptormutanten sind zwei Disulfidbrücken berechnet worden, und zwar zum einen die hochkonservierte zwischen Cys78 in TM3 und Cys167 im EL2, sowie eine weitere zwischen Cys72 (EL1) und Cys160 (EL2). Des Weiteren wurden die zwei β-Faltblatt-Strukturen im EL1 und EL2 vorhergesagt, die in den Kristallstrukturen des A2A-Rezeptors gefunden wurden und durch die Disulfidbrücken stabilisiert werden. Für den A2B-Rezeptor konnte experimentell nur eine essentielle Disulfidbrücke gefunden werden.44
Aus dem Homologiemodell und der daraus resultierenden 2D-Ligand-Rezeptor-Interaktion ergibt sich, dass der voluminöse Rest in 2’-Position des Agonisten CGS-21680 sterisch aus der Bindungstasche herausragt. Wichtig für die Bindung des Liganden scheint nach den Berechnungen die Aminosäure Phe169 im EL2 des A2A -Rezeptors zu sein, die mit dem Xanthingrundgerüst des Agonisten über π-π-Wechselwirkungen interagiert. Allerdings existiert im A2B-Rezeptor die homologe Aminosäure Phe173. Daher dürfte diese Aminosäure keinen großen Einfluss auf die Bindung von CGS-21680 haben. Alle anderen dargestellten Bindungen dürften nur eine untergeordnete Rolle spielen, da sie auch im A2B-Rezeptor vorhanden sind und dort CGS-21680 nicht binden. Dennoch könnte man die Bedeutung dieser Aminosäure überprüfen, indem CGS-21680 an der Rezeptormutante A2B(EL2-A2A-F169A) in Radioligand-Bindungsstudien und cAMP-Experimenten untersucht werden würde.
Sollte hierbei jeweils ein signifikanter Unterschied zum Wildtyp gemessen werden, dann wäre die Bedeutung der Aminosäure bestätigt.
4.1.5 Zusammenfassende Diskussion
Das interessanteste Ergebnis aus den Radioligand-Bindungsstudien und den cAMP-Akkumulationsexpermienten ist, dass der selektive A2A-Agonist CGS-21680 an die A2B -Rezeptor-Mutante mit der ausgetauschten zweiten extrazellulären Schleife des A2A -Rezeptors binden und diese aktivieren kann. Dies soll nach dem Computermodell an der Aminosäure Phe169 in der ausgetauschten zweiten extrazellulären Schleife des A2A -Rezeptors liegen. Des Weiteren soll der große voluminöse Rest in 2'-Position von CGS-21680 aus der Bindungstasche herausragen. Die zweite extrazelluläre Schleife hat zwar keinen Einfluss auf die Bindung von PSB-603 und NECA, jedoch auf die Bindung von BAY60-6583 und CGS-21680, wobei die Bindung stärker wird. Bei der A2B(EL2-A2A )-Rezeptormutante ist die maximale cAMP-Ausschüttung nach der Zugabe aller getesteten Agonisten Adenosin, NECA, CGS-21680 und BAY60-6583, stark erhöht verglichen mit den Wildtypen. Dies liegt offensichtlich daran, dass die zweite extrazelluläre Schleife die Rezeptor-Konformation verändert, insbesondere die fünfte Transmembrandomäne und die daran hängende dritte intrazelluläre Schleife. Dies führt möglicherweise zu einer leichteren Aktivierbarkeit, d.h. zu einem erleichtertem
„Umkippen“ oder „Shiften“ in die aktive Konformation.36, 279 Dadurch kann das G-Protein besser bzw. leichter aktiviert werden. Des Weiteren hat der EL2 auch einen Einfluss auf die Subtypselektivität von Liganden, insbesondere für Liganden mit einem
großen Rest, welcher in die zweite extrazelluläre Schleife hineinragt, wie CGS-21680 oder PSB-603.36, 39, 280
Die cAMP-Akkumulationsexperimenten mit A2B -Wildtyp-Rezeptoren mit NECA in Kombination mit CGS-21680 in verschiedenen Konzentrationen, zeigen keinen Einfluss CGS-21680 auf A2B-Rezeptoren.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die zweite extrazelluläre Schleife nicht nur einen großen Einfluss auf die Liganderkennung, sondern auch auf die Konformation und die Aktivierung des Rezeptors hat.