Charakterisierung der rekombinanten Viren

Nach erfolgreicher Herstellung der rekombinanten Viren wurde zunächst das Wachstumsverhal-ten der verschiedenen VirusmutanWachstumsverhal-ten in VeroE6-Zellen untersucht.

Hierzu wurden VeroE6-Zellen mit rMARV NPwt bzw. den entsprechenden Phosphorylierungsmu-tanten mit einer MOI von 1 infiziert. Für 7 Tage wurde täglich der Überstand abgenommen, zur Analyse der Mengen der viralen Proteine im Zelllysat und Überstand wurden die entsprechen-den Proben zur weiteren Bearbeitung mittels SDS-PAGE und Western Blot vorbereitet (3.4.2, 3.4.3). Die Titer der täglich gewonnenen Überstände wurden anschließend mittels TCID50-Assay ermittelt (3.3.3).

4. Ergebnisse

Abbildung 17: Wachstumskinetik der rMARV-Phosphorylierungsmutanten, Western Blots der Zellly-sate und Zellkulturüberstände.

VeroE6-Zellen wurden wie unter 3.3.4 beschrieben mit einer MOI von 0,1 infiziert, für 7 Tage wurde täglich der Überstand von den Zellen abgenommen und die Zellen lysiert, anschließend wurden die gewonnen Proben einer Western Blot-Analyse unterzogen. Die viralen Proteine wurden mit folgenden Antikörpern detektiert: VP40 mit α-VP40 (Maus) und NP mit α-NP (Maus); als Zweitantikörper wurde ein HRP-gekop-pelter α-Maus- Antikörper eingesetzt.

A. Proteinexpression und -freisetzung von rMARV NPwt.

B. Proteinexpression und -freisetzung der S619-Phosphorylierungsmutanten.

C. Proteinexpression und -freisetzung der S602-Phopshorylierungsmutanten.

In Abbildung 17 A sind die Proteinmengen im Zelllysat der mit rMARV NPwt infizierten Zellen in den Spuren 1-5, die Proteinmengen im Zellkulturüberstand in den Spuren 6-10 dargestellt. Virale Proteine ließen sich im Zelllysat ab Tag 3 nach der Infektion nachweisen (Abb. 17 A Spur 3), im Überstand wurden virale Proteine ab Tag 4 nach der Infektion detektiert (Abb. 17 A Spur 9).

Beim Vergleich der S619-Phosphorylierungsmutanten untereinander (Abb. 17 B) ließen sich an-hand der Proteinmengen im Western Blot keine Unterschiede in der Proteinmenge in den

Zell-Im Vergleich zum rMARV NPwt-Zellkulturüberstand (Abb. 17 A, Spur 10) wurden von den Zellen, die mit diesen Virusmutanten infiziert wurden, mehr Viren in den Überstand freigesetzt: Für rMARV NPS.SS.S-A (Abb. 17 B Spuren 5-10) und rMARV NPS.SS.S-D (Abb. 17 B Spuren 16-20) wurde im Western Blot ein verstärktes NP- sowie VP40-Signal detektiert. Im Vergleich der beiden Virus-mutanten untereinander ließ sich kein Unterschied in der Menge der freigesetzten Proteine de-tektieren.

Beim Vergleich der S602-Phosphorylierungsmutanten untereinander (Abb. 17 C) ließen sich ebenfalls keine deutlichen Wachstumsunterschiede detektieren: Weder in den Lysaten der infi-zierten Zellen (Abb. 17 C, Spuren 1-5 und 11-15) noch in den Zellkulturüberständen (Abb. 17 C, Spuren 6-10 und 16-20) unterschieden sich die Mengen der viralen Proteine NP und VP40.

Abbildung 18: Wachstumskinetik der rMARV-Phosphorylierungsmutanten, Wachstumskurven.

VeroE6-Zellen wurden wie unter 3.3.4 beschrieben mit einer MOI von 0,1 infiziert, für 7 Tage wurde täglich der Überstand von den Zellen abgenommen, anschließend wurden die Titer der so gewonnen Überstände bestimmt.

A. Kinetik der S619-Phosphorylierungsmutanten.

B. Kinetik der S602-Phopshorylierungsmutanten.

In Abbildung 18 sind die Verläufe der Titer der Zellkulturüberstände dargestellt, die mit Hilfe eines TCID50-Assays ermittelt wurden. Abbildung 18 A zeigt die Wachstumskinetik der S619-Phosphorylierungsmutanten, Abbildung 18 B bildet die Wachstumskurve der S602-Phosphory-lierungsmutanten ab. In beiden Diagrammen ist zum Vergleich auch jeweils die rMARV NPwt -Wachstumskurve dargestellt.

Analog zu den Western Blot Analysen ließen sich auch beim Verlauf der Wachstumskurven keine signifikanten Unterschiede bei den erreichten Titern sowohl im Vergleich zu rMARV NPwt als auch beim Vergleich der Mutanten untereinander feststellen, die Viren wuchsen im untersuch-ten Zeitraum von bis zu 7 Tagen nach der Infektion in einer vergleichbaren Geschwindigkeit und zu gleichen Titern.

Verteilung von NP in infizierten Zellen

Die Verteilung von NP in infizierten Zellen wurde mit Hilfe einer Immunfluoreszenzanalyse un-tersucht (3.4.1), bei der nach Fixierung das NP in infizierten Zellen angefärbt wurde.

4. Ergebnisse

Abbildung 19: Verteilung von NP in rMARV-infizierten Zellen.

HUH7-Zellen wurden wie unter 3.3.4 beschrieben mit einer MOI von 0,1 infiziert, 20 h nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und gefärbt. Das virale NP wurde mit folgenden Antikörpern detektiert: α-NP (Meerschweinchen) und α-Meerschweinchen (Ziege) 488 Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt.

Genau wie rMARV NPwt bildeten auch alle Phosphorylierungsmutanten die charakteristischen NP-inclusion bodies aus. In ihrer Größe und Form unterschied sich diese nicht von den inclusion bodies, die rMARV NPwt induziert. Auch die intrazelluläre Verteilung von NP war bei rMARV NPwt

und bei den untersuchten rMARV Mutanten vergleichbar.

Zusätzlich zu NP wurde in einer Doppelfärbung auch die intrazelluläre Verteilung von VP40 nach-gewiesen, durch lange Belichtungszeiten der Proben am Immunfluoreszenzmikroskop konnten einzelne Viruspartikel an der Zelloberfläche sichtbar gemacht werden. Hierbei wurde ein phä-notypischer Unterschied von rMARV NPS.SV.S-S im Vergleich zu den anderen Virusmutanten nach-gewiesen, mehr Viruspartikel (bzw. VP40-umschlossene Nukleokapside) waren an der Zellober-fläche detektierbar (s. Abb. 20 A, die Viruspartikel an der OberZellober-fläche sind durch Pfeilspitzen markiert). Durch Aufnahmen mehrerer Zellen und anschließende Auszählung wurde die Anzahl der Viruspartikel an der Oberfläche quantifiziert.

Abbildung 20: Viruspartikel an der Oberfläche rMARV-infizierter Zellen.

HUH7-Zellen wurden wie unter 3.3.4 beschrieben mit einer MOI von 0,1 infiziert, 20 h nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und gefärbt. Die Anzahl der Viruspartikel an der Zelloberfläche wurde manuell ausgezählt.

A. Immunfluoreszenzfärbung der infizierten Zellen. Die viralen Proteine wurden mit folgenden Antikör-pern detektiert: VP40 mit α-VP40 (Maus) und α-Maus (Ziege) 488; NP mit α-NP (Meerschweinchen) und α-Meerschweinchen (Ziege) 594; Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt. Die Viruspartikel an der Zellober-fläche wurden durch lange Belichtungszeiten sichtbar gemacht. Bildausschnitte sind jeweils vergrößert dargestellt, Pfeilspitzen markieren die Viruspartikel an der Zelloberfläche.

B. Anzahl der Viruspartikel an der Zelloberfläche. Pro Versuch wurden mindestens drei Zellen ausgezählt.

Die statistische Signifikanz wurde im Vergleich zu rMARV NPwt ermittelt: * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001.

Die S619-Phosphorylierungsmutanten rMARV NPS.SS.S-A und rMARV NPS.SS.S-D unterschieden sich in ihrem Phänotyp nicht von rMARV NPwt, die Anzahl der Viruspartikel an der Zelloberfläche war im Vergleich der Virusmutanten untereinander sowie zu rMARV NPwt vergleichbar (Abb. 20).

4. Ergebnisse Auch die S602-Phosphorylierungsmutante rMARV NPS.SD.S-S unterschied sich nicht von rMARV NPwt. Die Zellen, die mit rMARV NPS.SV.S.S infiziert wurden, zeigten allerdings deutlich mehr Virus-partikel an der Zelloberfläche, der Unterschied im Vergleich zu rMARV NPwt ist statistisch signi-fikant (Abb. 20 B).

Durch die Mutation von S602 liegt in Zellen, die mit rMARV NPS.SV.S-S infiziert sind, hauptsächlich die 92 kDa-Form von NP vor. Diese nichtphosphorylierte Konformation von NP scheint unter den gewählten Bedingungen eine Defizienz in der Abschnürung der neu gebildeten Viruspartikel von der infizierten Zelle zu besitzen.