Biochemische Methoden

2.2.2.1 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot Analyse

Für die Proteinanalyse mittels SDS-PAGE wurden Zellpellets in RIPA-Puffer (50mM Tris pH8, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat) mit 1x ProteaseinhibitorMix Complete^TM aufgeschlossen, 15min auf Eis inkubiert und die Zellfragmente anschließend bei 14.000rpm für 15min abzentrifugiert (Centrifuge 5417R). Das Lysat wurde abgenommen und die Proteinkonzentration durch Messung der Absorption bei 280nm (A280nm) bestimmt. (Die Absorption A280nm = 1 entspricht 1mg/ml Protein.) Äquivalente Proteinmengen wurden mit SDS-Probenpuffer (5x:

420mM Tris, 0,6M DTT, 30% Glycerol, 10% SDS, 0,1% Bromphenolblau) versetzt und nach 5min Denaturierung bei 95°C auf SDS-PA-Gele (Tab.2.4) aufgetragen. Als Molekulargewichtsstandard wurde der Proteinmarker PageRuler^TM Prestained Protein Ladder (Fermentas) verwendet.

Tab.2.4: Zusammensetzung von SDS-Polyacrylamid-Gelen. Für vier 1,5mm Minigele. (4x Trenngelpuffer: 1,5M Tris pH8.8, 0,4% SDS; 4x Sammelgelpuffer: 0,5M Tris pH6.8, 0,4% SDS).

Trenngel Sammelgel

8% 10% 4,5%

30% Acryl/Bisacrylamid 37,5:1 (AppliChem) ml 10,7 13,3 3

4x Trenngelpuffer ml 10 10 −

4x Sammelgelpuffer ml − − 5

aqua dest ml 19,3 16,7 12

TEMED µl 100 100 60

10% APS µl 100 100 60

Die Elektrophorese wurde in einem diskontinuierlichen Puffersystem (Laufpuffer: 25mM Tris, 200mM Glycin, 0,1% SDS) (Laemmli, 1970) bei maximal 120V durchgeführt. Anschließend wurden die nach

Material und Methoden

Masse getrennten Proteine aus dem Gel im semidry-Verfahren (25mM Tris, 200mM Glycin, 25% MeOH) 1h bei 400mA oder im Naß-Blot-Verfahren (25mM Tris, 200mM Glycin, 10% MeOH) 1h bei 70V auf Nitrocellulosemembranen transferiert. Die erfolgreiche Übertragung wurde durch Färbung der Membran mit PonceauS (1% PonceauS in 5% Essigsäure) geprüft. Zur weiteren Immundetektion der gewünschten Proteine wurde die Membran zunächst für 1h bei RT mit PBS, 5% Magermilchpulver, 0,4% Tween20 geblockt. Anschließend erfolgte ü.N. bei 4°C die Inkubation mit dem spezifischen primären Ak (in PBS, 2% Magermilchpulver, 0,1% Tween20). Nach dreimaligem Waschen für je 15min (PBS, 0,4% Tween20) wurde die Membran mit dem HRP-gekoppelten sekundären Ak für 1h bei RT inkubiert. Die Entwicklung der Membran erfolgte nach dreimaligem Waschen wie zuvor durch eine Chemolumineszenzreaktion mit ECL+ Substrat nach Anleitung des Herstellers. Zur Visualisierung der Signale wurde die Membran auf Röntgenfilm exponiert.

2.2.2.2 20S Proteasom Aufreinigung und in vitro Peptidverdau

20S Standardproteasomen (sP) wurden aus T2- bzw. Immunoproteasomen (iP) aus T2.27 Zellen isoliert und aufgereinigt, wie bereits zuvor beschrieben (Groettrup et al., 1995). Dazu wurde das Zellpellet (≥1*10⁹) in Lysepuffer (TEAD-Puffer (200mM Tris pH7.2, 10mM EDTA, 10mM NaN3, 1mM DTT) mit 50mM NaCl, 0,15% NP40) auf Eis resuspendiert und mit einem Dounce Homogenisator aufgeschlossen.

Nach Zentrifugation für 30min bei 16.000rpm (Avanti J-E) und 4°C wurde das Lysat mit DEAE-Sephacel Gel (Pharmacia) für 1-2h bei 4°C unter Rotieren inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch mehrmaliges Waschen mit 80mM NaCl-TEAD-Puffer entfernt und gebundenes Protein mit 500mM NaCl-TEAD-Puffer eluiert. Proteasom enthaltende Fraktionen wurden über Aktivitätsmessung mit fluorogenem Substrat Z-Gly-Gly-Leu-AMC (Bachem) und Proteinnachweis bestimmt und vereinigt. Im Folgenden wurden die Proteine mittels Ammoniumsulfat aus der Lösung gefällt und abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 50mM NaCl-TEAD-Puffer resuspendiert und auf einen 10-40%igen Saccharosegradienten aufgetragen. Die Ultrazentrifugation erfolgte bei 40.000rpm und 4°C für 16h (Ultrazentrifuge Ultra Pro80). Fraktionen mit Proteasom wurden erneut über Aktivitätsmessung und Proteinnachweis bestimmt und vereinigt. Des Weiteren erfolgte die Aufreinigung über FPLC (MonoQ HR5/5 Säule; Pharmacia) mit einem linearen Elutionsgradienten. Die Fraktionen wurden wiederum auf proteasomale Aktivität getestet und aktive Fraktionen mittels SDS-PAGE und Western Blot Analyse analysiert, entsprechend vereinigt und abschließend die Proteinkonzentration über A280nm (Abschnitt 2.2.2.1) bestimmt. Somit stand aufgereinigtes 20S Proteasom für weitere Versuche bereit.

Zum in vitro Verdau wurden 8µg des Peptids mit 0,8µg aufgereinigtem 20S Proteasom in 50µl Verdaupuffer (20mM Hepes/KOH pH 7.8, 2mM MgAc2, 2mM DTT) bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 0,5% TFA zum entsprechenden Zeitpunkt gestoppt. Die Proben wurden massenspektrometrisch analysiert.

Material und Methoden

2.2.2.3 Aufreinigung der Aminopeptidasen POP und AP-B und in vitro Peptidverdau

Zur Herstellung eines POP-Expressionsplasmids wurde die kodierende Sequenz von POP über die HindII/EcoRI - Schnittstellen in pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen) kloniert. Das humane C-terminal HIS-markierte POP wurde in E.coli BL21 exprimiert. Nach Ernte der Zellen wurden diese in Lysepuffer (50mM NaPO4, 300mM NaCl, pH8) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung und Frier-Tau-Zyklen solubilisiert. Das Lysat wurde mit Ni-NTA Agarose (Qiagen) inkubiert, ungebundene Proteine durch mehrmaliges Waschen entfernt und das gebundene HIS-markierte Protein mit Imidazol eluiert.

Nach Auftrennung mittels FPLC (MonoQ HR5/5 Säule; Pharmacia) mit einem linearen Elutionsgradienten wurden die Fraktionen über Größenausschluß-Gelfiltration (Superdex 200) gereinigt.

Mittels Aktivitätsmessung mit fluorogenem Substrat Z-Gly-Pro-AMC sowie SDS-PAGE und Western Blot Analyse wurden die POP enthaltenden Fraktionen bestimmt.

Rekombinante HIS-markierte AP-B der Ratte (Pham et al., 2007) wurde von Th. Foulon (Pierre und Marie Curie-Universität, Paris, Frankreich) zur Verfügung gestellt.

Zum in vitro Verdau wurden 20µg Peptid mit 5ng POP in 40µl Verdaupuffer (50mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, 1mM DTT) bzw. 50ng AP-B in 40µl Verdaupuffer ohne DTT bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5% TFA zu den angegebenen Zeitpunkten gestoppt und die Proben massenspektrometrisch analysiert.

Die Klonierung von POP wurde von Ingrid Krenz, Expression und Aufreinigung von Dr. B. Reimann (Institut für Biochemie - Charité, Berlin) durchgeführt.

2.2.2.4 Aktivitätstest mit fluorogenen Substraten

Für die Bestimmung der Aktivität der Aminopeptidasen AP-B und POP in Zelllysaten wurden fluorogene Substrate verwendet. Zellpellets wurden in Puffer (50mM Tris pH7.5, 50mM NaCl, 5mM MgCl2, 0,1%

TritonX) durch 3 Frier-Tau-Zyklen aufgeschlossen, 15min bei 14.000rpm zentrifugiert und anschließend wurden nach Proteinbestimmung wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.2.2.1) 5µg Lysat pro Reaktion eingesetzt. Die Aktivität der AP-B wurde in 50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl mit 50µM H-Arg-AMC Substrat und POP Aktivität in 50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1mM DTT mit 50µM Z-Gly-Pro-AMC Substrat bestimmt. Die Inkubation erfolgte in schwarzen Mikrotiterplatten in 100µl Gesamtvolumen bei 37°C. Die Fluoreszenz wurde bei 360nm Extinktion und 460nm Emission in Zeitintervallen von 30min bestimmt.

Material und Methoden

2.2.2.5 TAP-Peptid-Translokationsassay

Für die Bestimmung der Peptidtranslokation durch TAP wurden aus B-LCL Zellen präparierte Mikrosomen (Roelse et al., 1994) verwendet. Die Translokationseffizienz des Testpeptids wurde über die Konkurrenz um den Transport mit dem Fluorescein (FL) -markierten Referenzpeptid C(FL)VNKTERAY (Neisig et al., 1995) bestimmt, welches eine Konsensussequenz für N-Glycosylierung im ER besitzt. Die konkurrierenden Testpeptide wurden in unterschiedlicher Konzentration mit 0,5µM Referenzpeptid und den Mikrosomen in Transportpuffer (5mM Hepes pH7.3, 130mM KCl, 10mM NaCl, 1mM CaCl2, 2mM EGTA, 2mM MgCl2) unter Zugabe von 10mM ATP für 10min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von eiskaltem Transportpuffer mit 10mM EDTA gestoppt. Die Proben wurden gewaschen und in Lysepuffer (50mM Tris pH7.5, 500mM NaCl, 5mM MgCl2, 1% TritonX-100) resuspendiert. Nach 30min rotieren bei 4°C wurden Zelldebris für 10min bei 13.000rpm abzentrifugiert und das glykosylierte FL-markierte Referenzpeptid durch Inkubation mit Con-A Sepharose 4B (GE Healthcare) für 2h bei 4°C wiedergewonnen. Die Sepharose wurde dreimal mit Lysepuffer gewaschen und das Referenzpeptid mit 200µl Elutionspuffer (50mM Tris pH8, 500mM Mannopyranose, 10mM EDTA) durch 1h Schütteln bei RT eluiert. Die Fluoreszenz wurde bei 485nm Extinktion und 535nm Emission gemessen. Zur Kontrolle wurde die maximale Fluoreszenz in Proben ohne Testpeptid und die minimale in Proben ohne ATP mit 0,5M EDTA bestimmt.

Der TAP-Peptid-Translokationsassay wurde von Dr. F. Ossendorp (Universität Leiden, Niederlande) durchgeführt.