Biochemische Charakterisierung von BacA-Modulproteinen

Sequenzvergleiche mit diesen Proteinen zeigten jedoch keine Homologie zu den Z-Domänen von PPS. Somit kann davon ausgegangen werden, daß beide Systeme zwar ähnliche Reaktionen katalysieren, sich aber unabhängig voneinander entwickelt haben.

Substrate erkennt. Aus diesem Grund wurden die rekombinanten Proteine BacA1-AT, BacA2-AT und BacA1-2 in vitro mit der 4'-PAN-Transferase Sfp des Surfactin Biosynthese-systems aus B. subtilis modifiziert. Für dieses Enzym konnte vor kurzem gezeigt werden, daß es neben den SrfA-T-Domänen auch T-Domänen heterologer PPS-Systeme als Substrat akzeptiert und effektiv mit 4'-PAN belädt [Quadri et al., 1998; Weinreb et al., 1998]. Durch [³H]-CoA- und TCA-Präzipitationsexperimente konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß Sfp die T-Domänen der BacA-Modulproteine zu ca. 40 % mit 4'-PAN modifiziert. Dieser Wert entspricht in etwa 45 % der für SrfA-T-Domänen ermittelten Beladungseffizienz [Weinreb et al., 1998] und korreliert in guter Übereinstimmung mit den Daten anderer heterologer T-Domänen [Quadri et al., 1998].

Nachfolgend wurden die posttranslational modifizierten BacA-Modulproteine auf die Fähig-keit untersucht, ihre Substrataminosäuren kovalent als Thioester zu binden. Hierzu wurden [¹⁴C]-Ile- bzw. [³⁵S]-Cys-Beladungs- und TCA-Präzipitionsexperimente durchgeführt. Die bezüglich der 4'-PAN-Modifikation ermittelten relativen Beladungswerte von durchschnittlich 83 bis 91 % dokumentieren die hohe Effizienz der Thiolierungsreaktion [Weinreb et al., 1998]. Ähnlich wie bei der Adenylierung zeigten die Einzel- und Doppelmodulproteine auch in diesen Untersuchung nahezu identische Eigenschaften, so daß die funktionelle Aktivität des Doppelmodulproteins auch in Bezug auf seine Thiolierungsfähigkeit nachgewiesen werden konnte.

In weiterführenden Experimenten wurden die [¹⁴C]-Ile-Thiolierungseigenschaften von BacA1-2 in Gegenwart der zweiten Substrataminosäure Cys näher untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß nach einer Präinkubation des Proteins mit [¹⁴C]-Ile durch die Zugabe von nicht radioaktiv markiertem Cys eine stetige Abnahme der enzymgebundenen Radioaktivität induziert wurde. Diese Daten führten zur Formulierung des in Abbildung 5-16 dargestellten Modells. Demnach wird BacA1-2 zunächst mit seinen beiden Substrataminosäuren kovalent beladen, welche dann unter Ausbildung eines enzymgebundenen Dipeptides miteinander reagieren. Dieses als Thioester gebundene Dipeptid wird dann durch eine unkatalysierte hydrolytische Thioesterspaltung vom Enzym abgetrennt. Da die entstehenden Produkte nicht mehr als Substrate der BacA1-2 A-Domänen erkannt werden, nimmt im Laufe der Reaktion die enzymgebundene Radioaktivität rasch ab. Ähnliche Beobachtungen wurden vor kurzem auch von einem anderen PPS-Dimodulsystem berichtet, das sich aus rekombinantem GrsA und einem TycB1-Modulprotein 'ProCAT' (bestehend aus C-, A- und T-Domäne) zusammen-setzt [Stachelhaus et al., 1998]. Diese beiden Enzyme katalysieren in Gegenwart ihrer Substrataminosäuren Phe (GrsA) und Pro (ProCAT) die Bildung des Dipeptides Phe-Pro.

Wurden beide Enzyme zunächst getrennt mit ihren Substrataminosäuren beladen, wobei radioaktiv markiertes [¹⁴C]-Phe verwendet wurde, so konnte nach dem Mischen beider Enzyme anfänglich eine Verdopplung und nachfolgend eine rasche Abnahme der enzymge-bundenen Radioaktivität detektiert werden. Die Ursache für dieses Verhalten wird dadurch erklärt, daß das an GrsA gebundene [¹⁴C]-Phe unter Ausbildung eines Dipeptides auf ProCAT übertragen und die hierdurch frei gewordene T-Domäne von GrsA abermals mit [¹⁴C]-Phe beladen wird. So daß die absolute Menge an präzipitierbarer Radioaktivität verdoppelt wird.

Die nachfolgende Abnahme der Beladung resultiert aus einer autokatalytischen Abspaltung des Phe-Pro-Peptides unter Ausbildung eines Diketopiperazins. Somit weisen die beiden Systeme BacA1-2 und GrsA/ProCAT in Gegenwart ihrer beiden Substrataminosäuren ein ähnliches Thiolierungsverhalten auf, das die Annahme einer homologen Reaktionssequenz

nahelegt. Die im GrsA/ProCAT-System detektierte anfängliche Verdopplung der Beladung mit der ' ersten' Aminosäure ist bei BacA1-2 jedoch nicht zu detektieren. Die Gründe hierfür könnten in der unterschiedlichen Domänenorganisation beider Systeme liegen. So enthält BacA1-2 beide Module auf einer einzigen Polypeptidkette, wohingegen bei GrsA/ProCAT die Module auf zwei, voneinander getrennten Proteinen vorliegen. Aber auch Effekte, die auf spezifische Unterschiede zwischen C- und Z-Domänen zurückzuführen sind, können nicht ausgeschlossen werden (s. u.).

6.2.3 Analyse der von BacA1-2 gebildeten Produkte

Die von BacA1-2 in Gegenwart beider Aminosäuren gebildeten Produkte wurden mit Hilfe von Radio-DC und Reversed Phase HPLC eingehend charakterisiert. Hierdurch konnte die Fähigkeit des Doppelmodulproteins nachgewiesen werden, seine beiden Substrataminosäuren Ile und Cys unter Ausbildung einer Peptidbindung miteinander zu verknüpfen. Das anhand der Domänenorganisation von BacA1-2 zu erwartende Reaktionsprodukt eines thiazolin-haltigen Ile-Cys-Dipeptides konnte bisher jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Gründe hierfür sind noch unklar. Daher soll nun nachfolgend das BacA1-2 Protein detailliert mit dem im vorangegangenen Kapitel beschriebene Yersiniabatin-YbtE/HMWP2-System verglichen werden, für das eine in vitro Thiazolinringbildung nachgewiesen werden konnte (vgl.

Abbildung 6-1) [Gehring et al., 1998].

Die beiden Systeme YbtE/HMWP2 und BacA1-2 wurden heterolog in vergleichbaren E.-coli Stämmen expremiert und über eine analoge His₆-tag-Strategie aufgereinigt. Daher kann aus-geschlossen werden, daß die bei BacA1-2 ausbleibende Heterozyklenbildung auf einen, für die Zyklisierungsreaktion notwendigen, wirtsspezifischen Kofaktor zurückzuführen ist. Die Domänenausstattung beider Systeme ist sehr homolog und unterscheidet sich nur in dem Auftreten einer zusätzlichen Domäne unbekannter Funktion, welche in HMWP2 als Insertion zwischen der A- und der zweiten T-Domäne eingefügt ist. Derartige Domänen werden jedoch nicht in anderen homologen, an einer Thiazolinringsynthese beteiligten, PPS-Systemen ge-funden. Daher scheint eine spezifische Rolle dieser Domäne bei der Ringbildung eher un-wahrscheinlich und es kann geschlossen werden, daß die im Verhalten des YbtE/HMWP2-und BacA1-2-Systems auftretenden Unterschiede durch andere Faktoren zu erklären sind.

Hierfür könnte z. B. die unterschiedliche Domänenverteilung beider Systeme in Betracht ge-zogen werden. So sind im Yersiniabactin-System die Domänen auf zwei Proteine verteilt, wohingegen BacA1-2 alle Domänen auf einer einzigen Polypeptidkette enthält. Jedoch muß hierbei berücksichtigt werden, daß Salicylat nach seiner Aktivierung durch YbtE kovalent als Thioester auf HMWP2 überragen wird. Somit liegen auch in diesem System die beiden Substrate Sal und Cys als Thioester mit einem einzigen Protein verknüpft vor. Es kann ange-nommen werden, daß die nachfolgende Verknüpfung beider Substrate unabhängig von YbtE allein durch HMWP2 katalysiert wird. Somit läßt sich festhalten, daß beide Systeme zwar spezifische Unterschiede auf der Proteinebene aufweisen, diese jedoch nicht das Ausbleiben einer Thiazolinringbildung bei BacA1-2 nachhaltig erklären. Ein weiterer wichtiger Aspekt könnte in der unterschiedlichen Natur der funktionalisierten Substrate liegen. So ist der im Yersiniabactin-System gebildete Thiazolinring durch die Konjugation mit dem aromatischen System von Salicylat Resonanz-stabilisiert und seine Entstehung somit energetisch stark be-günstigt. Eine derartige Stabilisierung ist bei einem Ile-Cys-Thiazolin nicht möglich, so daß

seine Bildung vermutlich deutlich langsamer abläuft. In diesem Zusammenhang ist das Thio-lierungsverhalten von BacA1-2 bezüglich der ersten Aminosäure Ile von besonderem Interesse. Wie oben ausgeführt wurde, ist durch eine Cys-Zugabe keine Erhöhung der Ile-Be-ladung zu detektiern, wie es bei eigenständig agierenden PPS-Modulen eigentlich zu erwarten wäre [Stachelhaus et al., 1998]. Dieser Befund deutet darauf hin, daß das BacA1-2 Protein nach Bildung des linearen Dipeptides in einer Konformation varharrt, in der eine Kommuni-kation zwischen beiden Modulen aufrecht erhalten bleibt. Dies entspricht der vor kurzem postulierten Theorie, nach der die 4' -PAN-Arme drei mögliche Stellungen einnehmen können [De Crecy-Lagard et al., 1995; Stachelhaus et al., 1996b; Stein et al., 1996]: In der ersten Position wird der Kofaktor mit der entsprechenden Aminosäure beladen (Beladungs-Position); in der zweiten Position interagiert dieser Arm mit dem vorherigen Kofaktor und übernimmt von diesem die wachsende Peptidkette (Akzeptor-Position) und in der dritten Position reicht der Arm die nun um eine Aminosäure verlängerte Peptidkette an den Arm des nächsten Moduls weiter (Donor-Position). Die vorliegenden experimentellen Daten deuten somit darauf hin, daß nach der Bildung des Ile-Cys-Dipeptides der 4' -PAN-Kofaktor des ersten BacA1-2-Moduls in der Donor-Position und der zweite Kofaktor in der Akzeptor-Position fixiert werden. Dies könnte bedeuten, daß die normalerweise zwischen den beiden Modulen ablaufende Reaktion, nämlich die Ausbildung eines Thiazolinringes, nicht abge-schlossen ist. Nach dieser Interpretation erscheint es möglich, daß, obwohl BacA1-2 alle für die Thiazolinringbildung wichtigen katalytischen Einheiten besitzt, die Zyklisierungsreaktion kinetisch inhibiert ist. Die Gründe hierfür könnten in der verkürzten Struktur des BacA1-2 Proteins liegen, die eventuell eine optimale Orientierung aller katalytisch aktiven Reste zu-einander verhindert. Daher sollen in zukünftigen Experimenten, C-terminal verlängerte BacA1-2-Derivate erzeugt und auf ihre Fähigkeit der Heterozyklenbildung untersucht werden.

6.3 Identifizierung und Charakterisierung eines putativen Lichenysin